Conceito de GFP – Proteína Verde Fuorescente
A proteína verde fluorescente, GFP (do inglês Green Fluorescent Protein), é a primeira proteína naturalmente fluorescente que foi identificada. A sua descoberta revolucionou as ciências biológicas, permitindo visualizar células, organelos e processos biológicos entre outros.
Estrutura e propriedades bioquímicas
A GFP é uma pequena proteína constituída por 238 aminoácidos que formam onze cadeias β antiparalelas, cujo conjunto forma um cilindro no centro do qual encontra-se uma hélice α. Após ciclização e oxidação de três dos aminoácidos da hélice central, os aminoácidos serina, tirosina e glicina (nas posições 65, 66 e 67) forma-se um cromóforo, um grupo químico com capacidade de absorver e emitir luz. Quando uma luz ultravioleta (UV) ou azul incide no cromóforo, este absorve a luz e, a seguir, liberta energia emitindo luz verde. As extremidades N-terminal e C-terminal da GFP estão livres e acessíveis para ligação com outras proteínas.
A GFP é uma proteína estável, que tolera temperaturas até 65ºC e um pH de 5.5 a 12.2 e é resistente a tratamentos prolongados com protéases. Não necessita de substrato nem de co-fatores para fluorescer.
A forma monomérica da GFP selvagem apresenta um pico de excitação a 395nm e um pico menor a 475nm, dando origem a uma emissão única a 509nm, localizada na zona verde do espectro visível. A substituição da serina (Ser65) pela treonina (Thr65) criou uma forma mutante e melhorada da GFP, a EGFP (do inglês Enhanced Green Fluorescent Protein), 6 vezes mais fluorescente, que apresenta um pico predominante a 488nm e um pico de emissão mantido a 509nm.
Descoberta
A GFP foi descoberta em 1962, pelo investigador Osamu Shimomura e pelos seus colaboradores, nos laboratórios Friday Harbor da Universidade de Washington, quando estes estudavam a bioluminescência da medusa Aequorea victoria, um cnidário presente no Oceano Pacífico ao largo da América do Norte. Shimomura isolou e purificou uma proteína bioluminescente dependente do cálcio, à qual deu o nome de aequorina (referente à medusa) e verificou a presença de uma outra proteína que apresentava uma forte fluorescência verde quando exposta à luz UV. Esta proteína foi então designada de proteína verde fluorescente ou GFP.
Verificaram que quando a aequorina se liga ao cálcio, esta emite uma luz azul que, por sua vez, é absorvida pela GFP levando à emissão de uma luz verde.
No final dos anos 1980, o investigador americano Martin Chalfie começou a trabalhar com a GFP com o intuito de utilizar o gene desta proteína para visualizar a ativação de outros genes e a subsequente produção de proteínas. Chalfie e os seus colaboradores identificaram a localização do gene responsável pela síntese da GFP no genoma da Aequorea victoria. Em 1994, conseguiram incorporar este gene, por manipulação genética, na bactéria Escherichia coli, a qual passou a exibir a luz verde caraterística da GFP quando iluminada com uma luz UV. A seguir, inseriram o gene da GFP no nematode Caenorhabdistis elegans e conseguiram visualizar e entender pela primeira vez o desenvolvimento das células nervosas.
Em 1996, um outro grupo de investigadores eliminaram os intrões do gene da GFP permitindo a sua aplicação nas plantas.
Mais tarde, Roger Y. Tsien ampliou o espectro cromático das proteínas fluorescentes. A troca de aminoácidos na sequência da proteína da GFP permitiu obter variantes nas regiões do azul (BFP), ciano (CFP) e amarelo (YFP). A obtenção de uma fluorescência nas zonas do laranja e do vermelho só foi possível após a descoberta, por Sergey Lukyanov, de outra proteína semelhante à GFP mas com uma fluorescência vermelha. A proteína DsRED (do inglês Desired RED protein) foi encontrada num coral bioluminescente do género Discosoma. Tsien e os seus colaboradores desenvolveram novas variantes da GFP, a partir desta proteína, às quais deram nomes de frutos de acordo com a cor apresentada: mPlum, mCherry, mStrawberry, mOrange e mCitrine. Posteriormente, outros investigadores contribuíram para o alargamento do espectro, permitindo a marcação com diferentes cores e a observação de múltiplos processos em simultâneo.
Em 2008, Osamu Shimomura, Martin Chalfie e Roger Tsein foram galardoados com o Nobel da Química, pela descoberta e pelo desenvolvimento de estudos e de aplicações da GFP como marcador biológico.
Aplicações das proteínas fluorescentes
As proteínas fluorescentes são muito versáteis e são utilizadas tanto em microbiologia como em engenharia genética ou em fisiologia. Através de técnicas de ADN recombinante, o gene da GFP (ou proteínas similares) pode ser introduzido em culturas de células vivas ou em células específicas presentes num organismo intacto.
São usadas como sondas e, como tal, permitem a observação de processos até então invisíveis, tais como o desenvolvimento dos neurónios, o crescimento e disseminar de células cancerígenas, o desenvolvimento da doença de Alzheimer, o crescimento de bactérias patogénicas, a proliferação do vírus da SIDA, o processo de infeção de parasitas (por exemplo na doença de Chagas), a evolução das primeiras células do embrião, entre muitos outros. Também são aplicadas na área da biotecnologia ambiental na deteção de metais pesados e trinitrotolueno (TNT) em poços ou furos de água. Neste caso, utilizam-se bactérias geneticamente modificadas resistentes ao poluente em questão e que passam a fluorescer na sua presença.
References:
- Alberts, B. et al. (2008). Molecular biology of the cell. 5th ed. New York: Garland Science. p592-598.
- Charlfie, M. and Kain, S. R. (2006). Green fluorescent protein: Properties, applications and protocols. 2nd ed. New Jersey: Wiley – Interscience.
- Lodish, H. et al. (2004). molecular cell biology. 5th ed. New York: W.H. Freeman. p188-189.
- Xiao, J. (2009). Single-molecule imaging in living cells. In: Hinterdorfer, P. and Van Oijen A. Handbook of single-molecule biophysics. New York: Springer. p46-84.
