As proteínas estão no centro de ação dos processos biológicos. As proteínas funcionam como enzimas, que catalisam um conjunto de reações químicas complexas que são referidas como a vida. As proteínas servem como reguladores destas reações, de uma forma direta constituindo as enzimas e indiretamente sob a forma de mensageiros químicos, conhecidos como hormonas, bem como os recetores para essas hormonas. Elas atuam no transporte e armazenamento de substâncias biologicamente importantes como os iões metálicos, O2, glucose, lípidos, e muitas outras moléculas. A função das proteínas pode ser compreendida a partir da sua estrutura, isto é, a partir das relações tridimensionais entre os átomos constituintes. A estrutura primária de uma proteína corresponde à sequencia de aminoácidos da(s) sua(s) cadeia(s) polipeptídica(s).
Determinação da estrutura primária das proteínas
A primeira determinação completa de uma sequência de aminoácidos de uma proteína (insulina bovina), em 1953 por Frederick Sanger (1918-2013), teve um enorme significado bioquímico uma vez que se estabeleceu definitivamente a estrutura única que as proteínas possuem. Desde desta altura, foram determinadas milhares de sequências de aminoácidos de outras tantas proteínas. Esta informação tem sido de extrema importância na formulação dos conceitos bioquímicos modernos, uma vez que:
- O conhecimento da sequência de aminoácidos de uma proteína é essencial para a compreensão do seu mecanismo de ação molecular bem como um pré-requisito na elucidação das suas estruturas de raios-X e de ressonância magnética nuclear;
- A comparação das sequências de análogos de proteínas do mesmo individuo, de membros da mesma espécie, e de membros de espécies relacionadas permitiu importantes conclusões sobre como as proteínas funcionam e indicaram as relações evolutivas entre as proteínas e os organismos que as produzem. Estas análises complementam os estudos taxonómicos baseados em comparações anatómicas;
- A análise da sequência de aminoácidos tem aplicações clínicas importantes porque muitas doenças hereditárias são provocadas por mutações levando a uma alteração de um aminoácido numa proteína. O reconhecimento deste facto levou ao desenvolvimento de testes de diagnóstico para muitas doenças.
Ao longo de uma década, a elucidação da estrutura primária dos 51 resíduos de insulina foi o objetivo de muitos cientistas que, para tal, utilizaram mais de 100g de proteína. Os procedimentos para a determinação da estrutura primária têm sido tão refinados e automatizados que as proteínas de tamanho similar podem ser sequenciadas por um técnico experiente em dias e usando apenas alguns microgramas de proteína. Em 1978, a sequenciação da enzima β-galactosidase (1021 resíduos) permitiu concluir que praticamente todas as proteínas poderiam ser sequenciadas. Apesar destes avanços tecnológicos, os procedimentos básicos da determinação da estrutura primária usando técnicas químicas são os mesmos que foram desenvolvidos por Sanger. Este protocolo consiste em três partes conceptuais, em que cada uma requer vários passos laboratoriais:
- Preparação da proteína a sequenciar:
– Determinar o número de cadeias polipeptídeas (subunidades) quimicamente diferentes na proteína;
– Clivar as ligações dissulfeto da proteína;
– Separar e purificar as subunidades;
– Determinar a composição das subunidades de aminoácido.
- Sequenciar as cadeias polipeptídicas:
– Fragmentar as subunidades em pontos específicos, resultando em péptidos suficientemente pequenos para que sejam diretamente sequenciados;
– Separar e purificar os fragmentos;
– Determinar a sequência de aminoácidos de cada péptido;
– Repetir o passo 2a) com o processo de fragmentação de especificidade diferente para que a subunidade seja clivada em ligações peptídicas diferentes das anteriores. Separar os fragmentos como no passo 2b) e determinar a sequência de aminoácidos como no passo 2c).
- Organizar a estrutura completa:
– Ligar os pontos de clivagem dos diversos fragmentos peptídicos;
– Caso existam, elucidar as posições das pontes dissulfeto na subunidade ou entre cada uma delas.
Outros assuntos relacionados:
- Proteínas globulares
- Estrutura secundária da proteína
- Estrutura terciária da proteína
- Estrutura quaternária da proteína
- Estabilidade das proteínas
References:
– Barret, G.C. and Elmore, D.T., Amino Acids and Peptides, Chapter 5, Cambridge University Press (1998).
