Southern Blot

Conceito de Southern Blot

Southern blot diz respeito a uma técnica utilizada na Biologia Molecular através da qual é possível verificar se uma sequência de DNA específica (gene de interesse) está ou não presente na amostra em análise que contem uma mistura complexa (genoma inteiro de um organismo). Com esta técnica é, também, possível obter informações sobre a massa molecular e a quantidade relativa existente dessa sequência de DNA específica. O seu nome foi dado em homenagem ao seu inventor, Edwin Southern, um biólogo inglês que desenvolveu a técnica em 1970 na Universidade de Edimburgo. A técnica baseia-se na separação de fragmentos de DNA por peso molecular através de uma electroforese, seguindo-se a transferência para uma membrana e a detecção do fragmento de DNA de interesse por hibridação com uma sonda específica.

Procedimento:

1. Extração do DNA de uma amostra biológica (células ou tecido);
2. Fragmentação do DNA de elevado peso molecular presente na amostra, recorrendo-se a enzimas de restrição;
3. Separação dos fragmentos de DNA obtidos de acordo com o peso molecular, recorrendo-se a electroforese em gel de agarose (no gel aparecerá um smear devido ao elevado número de fragmentos presentes em cada amostra);
4. Desnaturação, ou separação, da cadeia dupla do DNA tornando-o DNA de cadeia simples, para tal é necessário tratar o gel onde foi realizada a electroforese com uma solução alcalina (normalmente composta por NaOH – hidróxido de sódio). Esta etapa é essencial uma vez que apenas DNA em cadeia simples tem a capacidade de hibridar com a sonda e que algum RNA ainda existente na amostra é destruído;
5. Transferência do DNA separado no gel para uma membrana de nitrocelulose ou de nylon, para tal é necessário colocar a membrana sobre o gel e aplicar pressão uniformemente distribuída sobre o gel, levando à ligação do DNA à membrana. Seguidamente, a membrana é aquecida (no caso da utilização de uma membrana de nitrocelulose) ou exposta a radiação UV (no caso da utilização de uma membrana de nylon) para fixar permanentemente o DNA à membrana;
6. Tratamento da membrana com a sonda, que se define como uma molécula de DNA ou RNA de cadeia simples cuja sequência é conhecida e complementar à sequência de DNA que se quer estudar, tornando possível a hibridação por complementaridade entre a sonda e a sequência de interesse. A sonda é marcada com átomos radioativos, corante fluorescente ou uma enzima que gera sinal quando entra em contato com um substrato, de forma a tornar possível a detecção dos locais de hibridação.
7. Lavagem da membrana com o objetivo de retirar toda a sonda que não hibridou, permanecendo na membrana apenas a sonda que hibridou na totalidade por complementaridade de bases com a sequência de interesse;
8. Detecção do padrão de hibridação, onde se utiliza autoradiografia em filme de raio-X no caso das sondas concebidas com átomos radioativos e corante fluorescente ou um método de detecção cromogénico no caso das sondas concebidas com enzimas. No caso de não ocorrer hibridação por não existir a sequência de DNA de interesse na amostra em estudo, apenas o marcador molecular emitirá cor.

References:

• Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L. (2002). Biochemistry (5th edition). W. H. Freeman, New York.
• Cooper G.M. (2000). The Cell: A Molecular Approach (2th edition). Sinauer Associates, Sunderland (MA).
• Griffiths A.J.F., Miller J.H., Suzuki D.T., Lewontin R.C., Gelbart W.M. (2000). An Introduction to Genetic Analysis (7th edition). W. H. Freeman, New York.
• Lodish H., Berk A., Zipursky S.L., Matsudaira P., Baltimore D., Darnell J. (2000). Molecular Cell Biology (4th edition). W. H. Freeman, New York.