Western Blot

Concepto de Western Blot

Wester Blot se refiere a una técnica utilizada en biología molecular a través de la cual es posible verificar si una proteína específica está o no presente en la muestra en análisis. Con esta técnica es también posible obtener informaciones sobre la masa molecular y la cantidad relativa existente de esa proteína específica. Fue descrita por Towbin, et.al, en 1979 en el Instituto Friedich Miescher, adoptó su nombre por ser una variación al Southern blot. La técnica se basa en la separación de las proteínas por peso molecular a través de una electroforesis, siguiéndole la transferencia para una membrana y la detección de la proteína de interés por hibridación con un anticuerpo específico.

Procedimiento:

1. Extracción de las proteínas de una muestra biológica (células o tejido);
2. Desnaturación de las proteínas para convertirse en moléculas de estructura primaria, recurriéndose a la adición de un tamaño que contiene SDS (dodecil sulfato de sodio) seguido de calentamiento breve de la muestra (95º durante 5 minutos);
3. Separación de las proteínas presentes en la muestra de acuerdo con su peso molecular, a través de una electroforesis en gel SDS-PAGE;
4. Transferencia para la membrana de nitrocelulosa o PVDF, a través de corriente eléctrica;
5. Bloqueo de la membrana, a través del tratamiento de la membrana con un tapón que contiene proteínas (normalmente BSA o leche) que se van a unir a todos los lugares libres en la membrana. Este paso es fundamental para impedir que el anticuerpo se una inespecíficamente a la membrana llevando a la aparición de background;
6. Detección de la proteína, donde en una primera fase se utiliza un anticuerpo primario que es específico para una determinada secuencia presente en la proteína que se quiere estudiar, volviendo posible la hibridación por complementariedad entre el anticuerpo y la proteína de interés; en una segunda fase, se utiliza un anticuerpo secundario (que es sintetizado en la misma especie de animal donde fue sintetizado el anticuerpo primario) que está unido a una enzima que genera señal cuando entra en contacto con un sustrato, como por ejemplo la biotina;
7. Lavado de la membrana con el objetivo de retirar todo el anticuerpo que no hibridó, permaneciendo en la membrana apenas el anticuerpo que hibridó con la proteína de interés;
8. Detección del patrón de hibridación, donde se utiliza autoradiografía en filme radiográfico en el caso de anticuerpos concebidos con átomos radioactivos, colorante fluorescente o un método de detección cromogénico en el caso de anticuerpos concebidos  con enzimas o fotosensor en el caso del anticuerpo haber sido marcado con fluorescencia. En el caso de no ocurrir hibridación por no existir la proteína de interés en la muestra en estudio, apenas el marcador molecular emitirá color.