Western Blot

Conceito de Western Blot

Western blot diz respeito a uma técnica utilizada na Biologia Molecular através da qual é possível verificar se uma proteína específica está ou não presente na amostra em análise. Com esta técnica é, também, possível obter informações sobre a massa molecular e a quantidade relativa existente dessa proteína específica. Tendo sido descrita por Towbin, et.al, em 1979 no Instituto Friedrich Miescher, adotou o seu nome por ser uma variação ao Southern blot. A técnica baseia-se na separação das proteínas por peso molecular através de uma electroforese, seguindo-se a transferência para uma membrana e a detecção da proteína de interesse por hibridação com um anticorpo específico.

Procedimento:

1. Extração das proteínas de uma amostra biológica (células ou tecido);
2. Desnaturação das proteínas para se tornarem moléculas de estrutura primária, recorrendo-se à adição de um tampão que contem SDS (dodecil sulfato de sódio) seguido de aquecimento breve da amostra (95ºC durante 5 minutos);
3. Separação das proteínas presentes na amostra de acordo com o seu peso molecular, através de uma electroforese em gel SDS-PAGE;
4. Transferência para membrana de nitrocelulose ou PVDF, através de corrente elétrica;
5. Bloqueio da membrana, através do tratamento da membrana com um tampão que contem proteínas (normalmente BSA ou leite) que se vão ligar a todos os locais livres na membrana. Este passo é fundamental para impedir que o anticorpo de ligue inespecificamente à membrana levando ao aparecimento de background;
6. Detecção da proteína, onde numa primeira fase se utiliza um anticorpo primário que é específico para uma determinada sequência presente na proteína que se quer estudar, tornando possível a hibridação por complementaridade entre o anticorpo e a proteína de interesse; numa segunda fase, utiliza-se um anticorpo secundário (que é sintetizado na mesma espécie animal onde foi sintetizado o anticorpo primário) que está ligado a uma enzima que gera sinal quando entra em contato com um substrato, como por exemplo a biotina;
7. Lavagem da membrana com o objetivo de retirar todo o anticorpo que não hibridou, permanecendo na membrana apenas o anticorpo que hibridou com a proteína de interesse;
8. Detecção do padrão de hibridação, onde se utiliza autoradiografia em filme de raio-X no caso de anticorpos concebidos com átomos radioativos, corante fluorescente ou um método de detecção cromogénico no caso de anticorpos concebidos com enzimas ou fotosensor no caso do anticorpo ter sido marcado com flourescência . No caso de não ocorrer hibridação por não existir a proteína de interesse na amostra em estudo, apenas o marcador molecular emitirá cor.