Concepto de la Tinción de Gram
Tinción de Gram es la designación atribuida a una técnica de coloración de baterías creada por Hans Christian Gram, un médico danés. Esta técnica también es conocida como coloración de Gram, puesto que colora las paredes celulares de las baterías, permitiendo distinguir dos tipos de bacterias, las Grampositivas y las Gramnegativas.
Esta técnica fue desarrollada en 1884 por un bacteriologista (Hans Gram), que se dio cuenta de que ciertas paredes celulares bacterianas coloraban de diferentes colores cuando eran tratadas por colorantes diferentes. La Tinción de Gram permite así distinguir diferentes tipos de bacterias creando así dos grandes grupos.
Esta distinción fue muy útil en el estudio de las bacterias, facilitando así la identificación de las bacterias en tejidos infectados. Puesto que gran parte de las baterías identificadas corresponden a bacterias patológicas, este método es de gran importancia en el estudio de infecciones. La distinción entre los dos grupos ocurre por diferencias en la constitución de la pared celular que permite la fijación o no del colorante, haciéndolo un método bastante rápido.
A lo largo de los años desde que fue descubierta esta técnica fue sufriendo algunas alteraciones, principalmente en lo que se refiere a los reagentes utilizados de forma a permitir la obtención de mejores resultados.
Procedimiento
- Las células bacterianas son retiradas de un cultivo joven, en medio del cultivo sólido, realizándose un frotis;
- A continuación, se realiza el secado y fijación del frotis con calor, en una lámina;
- Inmersión del frotis en el reagente violeta de cristal (colorante primario) durante un minuto;
- Lavado con agua destilada;
- Inmersión de la lámina, con el frotis, en yodo de Gram o soluto de Lugol durante un minuto;
- Lavado con agua destilada;
- Lavado con solución de alcohol al 95% o con acetona (decolorante/disolvente lipídico), durante algunos segundos;
- Lavado con agua destilada;
- Inmersión del frotis en Safranina o Fucsina (contrastante) durante algunos segundos;
- Lavado con agua destilada, secado y posterior observación utilizando un microscopio.
Las bacterias Grampositivas
Estas bacterias tienen la capacidad de fijar el soluto inicial, impidiendo que éste sea llevado cuando entre en contrato con el disolvente orgánico. Las bacterias que pertenecen a este grupo presentan una pared celular más espesa y homogénea (debido a la disposición de los peptidoglicanos), pudiendo ser el colapso de esa pared espesa la razón para que la coloración no se pierda.
La pared de estas células permite la entrada del colorante, siendo que éste forma un precipitado insoluble, cuando entra en contacto con el soluto de Lugol, pasa a quedarse atrapado en el interior de la pared, no siendo posible decolorarlas. El proceso descrito anteriormente hace con que estas bacterias presenten una coloración azulada o violácea.
Las bacterias Gramnegativas
Estas bacterias pierden la coloración dada por el colorante inicial, cuando entran en contacto con el disolvente orgánico. Una vez que pierden el color inicial, estas bacterias pasan a presentar el color del segundo colorante que fue introducido.
Su pared celular es más fina que la presente en las bacterias Grampositivas, además de ser estratificada, presentado una membrana externa y una capa más interna constituida por peptidoglucanos que es rodeada por lipoproteínas, fosfolípidos entre otras proteínas. Estas bacterias son bastante más resistentes que las bacterias Grampositivas.
La capa de lípidos es eliminada en el momento del tratamiento con alcohol/acetona permitiendo un aumento de la permeabilidad de la pared celular. Esta permeabilidad deja de salir el colorante, permitiendo la decoloración de las bacterias.
La estructura de esta pared permite así la eliminación del precipitado que se forma por la reacción del colorante con el soluto de Lugol, quedando la pared decolorada. Posteriormente es adicionado un contrastante que colorará la pared de rojo pasando estas bacterias a presentar una coloración rojiza.
A pesar de ampliamente usada, esta técnica no tiene una tasa de éxito del 100%, puesto que no siempre da los resultados correctos, siendo posible que bacterias Grampositivas surjan como Gramnegativas.
Muchas veces los resultados obtenidos no corresponden a la verdadera clasificación de la bacteria pues esta técnica depende de varios factores entre los cuales: correcta implementación de esa técnica, así como de la edad de la colonia (colonias bacterianas viejas no dan resultados verdaderos), otros factores también pueden influir en los resultados de este método.
Por ese motivo es recomendado que se realice un control de calidad en lo que se refiere al método de forma a asegurar que los resultados sean los más correctos. Una de las formas de control es inicialmente realizar el método en una colonia conocida de forma a observar si el resultado obtenido es el esperado.
References:
- Martins, Cláudia et al. (2001). Técnica de Coloraçao de Gram. Brasilia: Ministerio da Saúde, Programa Nacional de Doenças Sexualmente Transmissíveis e AIDS. 63 p.: iI. (Série TELELAB)
- Minnerath, Jeanne M.; Roland, Jenna M.; Rossi, Lucas C.; Weishalla, Steven R.; Wolf, Melissa M. (2009). A Comparison of Heat Versus Methanol Fixation for Gram Staining Bacteria. Bioscene Volume 35(2).
