Conceito do Método de Gram
Método de Gram é a designação atribuída a uma técnica de coloração de bactérias criada por Hans Christian Gram, um médico dinamarquês. Esta técnica também é conhecida por coloração de Gram uma vez que colora as paredes celulares das bactérias, permitindo distinguir dois tipos de bactérias, as Gram-positivas e as Gram-negativas.
Esta técnica foi desenvolvida em 1884 por um bacteriologista (Hans Gram), que se apercebeu que certas paredes celulares bacterianas coravam de diferentes cores quando eram tratadas por corantes diferentes. O Método de Gram permite assim a distinguir diferentes tipos bactérias criando assim dois grandes grupos.
Esta distinção tornou-se muito útil no estudo das bactérias, facilitando assim a identificação das bactérias em tecidos infectados. Uma vez que grande parte das bactérias identificadas correspondem a bactérias patológicas, este método é de grande importância no estudo de infecções. A distinção entre os dois grupos ocorre por diferenças na constituição da parede celular que permite a fixação ou não do corante, tornando-o num método bastante rápido.
Ao longo dos anos desde que foi descoberta, esta técnica foi sofrendo algumas alterações, principalmente no que diz respeito aos reagentes utilizados de forma a permitirem a obtenção de melhores resultados.
Procedimento
- As células bacterianas são retiradas de uma cultura jovem, em meio de cultura solido, sendo realizado um esfregaço;
- Seguidamente realiza-se secagem e fixação do esfregaço com calor, numa lâmina;
- Imersão do esfregaço no reagente violeta de cristal (corante primário) durante um minuto;
- Lavagem com água destilada;
- Imersão da lâmina, com o esfregaço, em iodo de Gram ou soluto de Lugol (mordante) durante um minuto;
- Lavagem com água destilada;
- Lavagem com solução de álcool a 95% ou com acetona (descolorante/solvente lipídico), durante alguns segundos;
- Lavagem com água destilada;
- Imersão do esfregaço em Safranina ou Fucsina (contrastante) durante alguns segundos;
- Lavagem com água destilada, secagem e posterior observação utilizando um microscópio.
As bactérias Gram-positivas
Estas bactérias têm a capacidade de fixar o soluto inicial, impedindo que este seja levado quando em contacto com o solvente orgânico. As bactérias que pertencem a este grupo apresentam uma parede celular mais espessa e homogénea (devido à disposição dos peptidoglicanos), podendo ser o colapso dessa parede espessa a razão para que a coloração não se perca.
A parede destas células permite a entrada do corante sendo que este forma um precipitado insolúvel com quando em contacto com o soluto de Lugol, passando este a ficar preso no interior da parede, não sendo possível descolora-las. O processo descrito anteriormente faz com que estas bactérias apresentem uma coloração azulada ou arroxeada.
As bactérias Gram-negativas
Estas bactérias perdem a coloração dada pelo corante inicial, quando em contacto com o solvente orgânico. Uma vez que perderam a cor inicial, estas bactérias passam a apresentar a cor do segundo corante (mordante) que foi introduzido.
A sua parede celular é mais fina do que a presente nas bactérias Gram-positivas, além de ser estratificada, apresentando uma membrana externa e uma camada mais interna de constituída por peptidoglicanos que é rodeada por lipoproteínas, fosfolípidos entre outras proteínas. Estas bactérias são bastante mais resistentes do que as bactérias Gram-positivas.
A camada de lípidos é removida, a quando do tratamento com álcool/ acetona permitindo um aumento da permeabilidade da parede celular. Esta permeabilidade deixa sair o corante, permitindo a descoloração das bactérias.
A estrutura desta parede permite assim a remoção do precipitado que se forma pela reacção do corante com o soluto de Lugol, ficando a parede descolorada. Posteriormente é adicionado um contrastante que irá corar a parede de vermelho passando estas bactérias a apresentar uma coloração avermelhada.
Apesar de amplamente usada, esta técnica não tem uma taxa de sucesso de 100%, uma vez que nem sempre dá os resultados correctos, sendo possível que bactérias Gram-positivas surjam como Gram-negativas.
Muitas vezes os resultados obtidos não correspondem à verdadeira classificação da bactéria pois esta técnica depende de vários factores entre os quais: correta implementação dessa técnica, assim como da idade da colónia (colónias bacterianas velhas podem não dar resultados verdadeiros), outros factores também podem influenciar os resultados deste método.
Por esse motivo é recomendado que se realize um controlo de qualidade no que diz respeito ao método de forma a assegurar que os resultados são os mais correctos. Uma das formas de controlo é inicialmente realizar o método numa colónia conhecida de forma a observar se o resultado obtido é o esperado.
References:
- Martins, Cláudia et al. (2001). Técnica de Coloraçao de Gram. Brasilia: Ministerio da Saúde, Programa Nacional de Doenças Sexualmente Transmissíveis e AIDS. 63 p.: iI. (Série TELELAB)
- Minnerath, Jeanne M.; Roland, Jenna M.; Rossi, Lucas C.; Weishalla, Steven R.; Wolf, Melissa M. (2009). A Comparison of Heat Versus Methanol Fixation for Gram Staining Bacteria. Bioscene Volume 35(2).
