Concepto de Southern Blot
Southern blot se refiere a una técnica utilizada en Biología Molecular a través de la cual es posible verificar si una secuencia de ADN específica (gen de interés) está o no presente en la muestra en análisis que contiene una mezcla compleja (genoma entero de un organismo). Con esta técnica es también posible obtener informaciones sobre la masa molecular y la cantidad relativa existente de esa secuencia de ADN específica. Su nombre fue dado en homenaje a su inventor, Edwin Southern, un biólogo inglés que desarrolló la técnica en 1970 en la Universidad de Edimburgo. La técnica se basa en la separación de fragmentos de ADN por peso molecular a través de una electroforesis, siguiendo la transferencia para una membrana y la detección del fragmento de ADN de interés por hibridación con una sonda específica.
Procedimiento:
- Extracción del ADN de una muestra biológica (células o tejido);
- Fragmentación del ADN de elevado peso molecular presente en la muestra, recurriendo a enzimas de restricción;
- Separación de los fragmentos de ADN obtenidos de acuerdo con el peso molecular, recurriendo a la electroforesis en gel de agarosa (en el gel aparecerá un smear debido al elevado número de fragmentos presentes en cada muestra);
- Desnaturalización o separación de la cadena doble del ADN haciéndolo ADN de cadena simple, para ello es necesario tratar el gel donde fue realizada la electroforesis con una solución alcalina (normalmente compuesta por NaOH – hidróxido de sodio). Esta etapa es esencial puesto que apenas el ADN en cadena simple tiene la capacidad de hibridar con la sonda y que algún ARN aún existente en la muestra es destruido;
- Transferencia del ADN separado en el gel para una membrana de nitrocelulosa o de nylon, para ello es necesario colocar la membrana sobre el gel y aplicar presión uniformemente distribuida sobre el gel, llevando a la unión del ADN a la membrana. Seguidamente, la membrana es calentada (en el caso de la utilización de una membrana de nylon) para fijar permanentemente el ADN a la membrana;
- Tratamiento de la membrana con la sonda, que se define como una molécula de ADN o ARN de cadena simple cuya secuencia es conocida y complementaria a la secuencia de ADN que se quiere estudiar, haciendo posible la hibridación por complementariedad entre la sonda y la secuencia de interés. La sonda es marcada con átomos radioactivos, colorante fluorescente o una enzima que genera señal cuando entra en contacto con un sustrato, de forma a hacer posible la detección de los lugares de hibridación.
- Lavado de la membrana con el objetivo de retirar toda la sonda que no hibridó, permaneciendo en la membrana apenas la sonda que hibridó en la totalidad por complementariedad de bases con la secuencia de interés;
- Detección del patrón de hibridación, donde se utiliza película de autoradiografía de rayo X en el caso de las sondas concebidas con átomos radioactivos y colorante fluorescente o un método de detección cromogénico en el caso de las sondas concebidas con enzimas. En el caso de no ocurrir hibridación por no existir la secuencia de ADN de interés en la muestra en estudio, apenas el marcador molecular emitirá color.
References:
- Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L. (2002). Biochemistry (5th edition). W. H. Freeman, New York.
- Cooper G.M. (2000). The Cell: A Molecular Approach (2th edition). Sinauer Associates, Sunderland (MA).
- Griffiths A.J.F., Miller J.H., Suzuki D.T., Lewontin R.C., Gelbart W.M. (2000). An Introduction to Genetic Analysis (7th edition). W. H. Freeman, New York.
- Lodish H., Berk A., Zipursky S.L., Matsudaira P., Baltimore D., Darnell J. (2000). Molecular Cell Biology (4th edition). W. H. Freeman, New York.
