Enzimas de restricción

Las enzimas de restricción, también denominadas endonucleasas de restricción, desempeñan la función de clivaje (corte) de la molécula de ADN en reconocimiento a determinadas secuencias de nucleótidos.

Estas enzimas reconocen secuencias de 4 a 8 nucleótidos, los denominados sitios de restricción.

En la figura que se presenta es posible verificar la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción EcoRI, así como los fragmentos en secuencia del corte.

Fueron inicialmente descubiertas en células bacterianas, relacionadas al mecanismo de defensa contra el ADN exógeno, inactivando el organismo invasor a partir de la fragmentación del material genético del mismo.

El nombre de la enzima tiene origen en el nombre del organismo del cual fue aislada, de esta forma:

  • EcoRI
    E: Escherichia (género)
    co: coli (especie)
    R: 
    RY13 (estirpe)
    I:  orden de identificación de la bacteria

Algunas de estas “tijeras moleculares” son herramientas clave en técnicas de biotecnología molecular puesto que cada enzima de restricción, reconoce y fragmenta una región específica de la molécula de ADN, produciendo siempre el mismo conjunto de fragmentos de ADN. Una enzima de restricción permite cortar moléculas de ADN de forma controlada y reproducible.

De esta forma, los fragmentos generados pueden ser sometidos a la técnica de electroforesis en gel, y a través de análisis comparativo de los perfiles generados es posible, por ejemplo, la identificación de personas (sospechosas de un crimen o determinación de paternidad).

Estas enzimas cortan el ADN en zigzag dejando extremidades de cadena única (extremidades cohesivas), permitiendo el emparejamiento de “colas” de diferentes fragmentos de ADN cortados con la misma enzima. Estos fragmentos emparejados pueden después ser unidos por la enzima ADN ligasa con consumo de ATP.

Actualmente, numerosas enzimas de restricción ya fueron purificadas de varias especies de bacterias, la mayoría de las cuales reconoce diferentes sitios de restricción, siendo ampliamente comercializadas.

Tipos de enzimas de restricción 

La clasificación de las diferentes enzimas de restricción está basada en la composición de la secuencia nucleotídica, posición de clivaje, secuencia de reconocimiento, cofactores envueltos y estructura de la enzima en causa:

Tipo I (Impide su uso en ingeniería genética)

  • 3 subunidades: 1 subunidad de restricción (“R”), 1 subunidad de metilación (“M”) y 1 subunidad de reconocimiento (“S”);
  • Secuencia de reconocimiento es asimétrica;
  • Lugar de hidrólisis no es específico y ocurre a más de 1000 bp de distancia;
  • Hidrólisis está siempre en un lugar diferente y necesita ATP.

Tipo II (Importantes herramientas en ingeniería genética debido a la especificidad de corte)

  • Dos enzimas: 1 enzima de restricción (Endonucleasa) y 1 enzima de metilación (Metilasa);
  • Estructura con 4 hojas β y 1 hélice α;
  • Secuencia de reconocimiento es palindrómica 4 a 8 nucleótidos;
  • Hidrólisis ocurre dentro o en las extremidades de la secuencia reconocida;
  • No necesita ATP, apenas Mg2+

Tipo III (Impide su uso en ingeniería genética)

  • 2 subunidades: 1 subunidad de restricción (“R”) y 1 subunidad de metilación y reconocimiento (“MS);
  • Secuencia de reconocimiento es asimétrica (5-7 bp);
  • Doble cadena de ADN hemimetilada;
  • Lugar de hidrólisis a más de 24-26 bp de distancia;
  • Hidrólisis es siempre en un lugar diferente y necesita ATP

Factores que influyen en la actividad de las enzimas de restricción

Composición del tampón

  • Difieren en la fuerza iónica (concentración de sal);
  • Difieren en el catión principal (Na+ o K+);
  • Solución: Mantener el pH de la reacción;

Temperatura de incubación

  • La temperatura óptima de la mayoría de las enzimas es de 37ºC;

Excepciones: Bacterias termofílicas – temperatura óptima de clivaje varía entre 50 a 60ºC;

Influencia de la metilación en el ADN

  • Existen algunas endonucleasas de restricción que no clivan ADN metilado;

Digestión con múltiples enzimas

Existen numerosas bases de datos donde es posible consultar información sobre enzimas de restricción y sus sitios de reconocimiento. A REBASE® The Restriction Enzyme Database (http://rebase.neb.com) es una herramienta muy útil, especialmente desarrollada para uso en biología molecular y bioinformática.

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References:

Kulg; Cunnings (1997). Concepts of Genetics 5th ed., Internacional edition, Prentice Hall, USA.

Watson, James D. (1992). Molecular Biology of the Gene 3rd ed., Benjamin/Lumming, Harvard University and Cold spring Haba laboratory.

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