Transformação Genética de Plantas
Existem duas barreiras físicas que impedem a entrada de DNA estranho no núcleo de uma célula vegetal: a parede celular e a membrana citoplasmática. A maioria dos métodos de transformação de plantas ultrapassa estas duas barreiras recorrendo a abordagens físico-químicas. Este métodos podem ser divididos em:
- Métodos indiretos – envolvem a utilização de organismos que funcionam como vetores de transmissão do DNA que se deseja inserir na célula;
- Métodos diretos – existe contato direto entre o DNA estranho e a célula que se deseja transformar.
A transformação de células vegetais com Agrobacterium tumefaciens é considerado um método indireto. Esta bactéria do solo gram-negativa possui um plasmídeo especial – plasmídeo Ti – que funciona como veículo para a introdução de DNA estranho nas células vegetais. Originalmente, o plasmídeo Ti é responsável pela produção de tumores nas plantas, que são consequência da transferência, integração e expressão de genes (contidos num segmento específico do plasmídeo – o T-DNA) no genoma da célula vegetal. Este processo infecioso inicia-se devido à existência de um ferimento na planta, o que permite a união da bactéria à superfície da célula vegetal. Como resposta ao ferimento, as plantas libertam compostos fenólicos que vão induzir a expressão dos genes vir, presentes no plasmídeo Ti. Os produtos destes genes são essenciais para que ocorra a transferência e a integração do T-DNA no genoma da célula. Após a integração do T-DNA, inicia-se a expressão dos seus genes (oncogenes e genes responsáveis pela síntese de opinas, que irão levar à formação do tumor).
Utilizando as características originais do plasmídeo Ti, é possível desenhar um T-DNA que contenha um gene que permitirá selecionar as plantas transformadas e o gene de interesse a introduzir no genoma que queremos alterar. Os genes responsáveis pela formação dos tumores são removidos, assim como os genes que produzem fitohormonas. A transformação com Agrobacterium consiste nos seguintes passos:
- Cultivo da bactéria que contém o gene de interesse com os explantes;
- Cultivo dos explantes infetados em meio de regeneração que contém um agente seletivo, que permite eleger as plantas transformadas, e um antibiótico que irá reduzir o crescimento bacteriano;
- Seleção dos rebentos resistentes ao agente seletivo;
- Se possível, verificar a veracidade da transformação realizando um ensaio para o gene inserido;
- Enraizamento dos rebentos que foram transformados.
A transformação de protoplastos é um método direto de introdução de DNA numa célula vegetal. Este envolve a digestão enzimática da parede celular originando-se protoplastos (células vegetais sem parede celular) que são mantidos em meio de cultura osmoticamente controlado. A introdução do DNA na célula pode ocorrer pela aplicação de um campo elétrico, que induz a formação transitória de poros na membrana citoplasmática, por aplicação de um choque químico ou pela microinjeção do DNA no seu interior. A entrada da nova informação genética pode ser facilitada pela adição de agentes permeabilizantes da membrana, que também auxiliam a incorporação do DNA por um processo de neutralização das cargas deste dentro da célula. Ao contrário da transformação por Agrobacterium, esta técnica não apresenta limitações quanto ao hospedeiro que se quer transformar, desde que os sistemas vegetais sejam capazes de regenerar plantas a partir de protoplastos. No entanto, este tipo de transformação pode levar à integração de múltiplas cópias e rearranjos do DNA estranho.
Outro método direto de transformação de plantas é através do bombardeamento de partículas ou método biolístico. Neste caso são utilizadas pequenas partículas de metal (tungsténio ou ouro) cobertas com o DNA que se pretende introduzir na célula, que depois são aceleradas com um gás sob pressão, penetrando o tecido vegetal. O DNA pode ser inserido em vários compartimentos celulares aleatoriamente. Este método tem como vantagens a possibilidade de transformação de tecidos organizados, um maior número de células alteradas (a dispersão da informação genética introduzida é homogénea), a transformação de espécies recalcitrantes (plantas cuja regeneração in vitro é difícil ou impossível) e o estudo de processos básicos em plantas (com a introdução de genes marcadores cromogénicos). Contudo, apresenta uma baixa taxa de sucesso, as espécies vegetais exibem um elevado número de cópias do DNA estranho e é um método bastante oneroso.
A transformação das plantas pode ser confirmada e caracterizada quanto à sua eficiência, recorrendo-se a diversos métodos de biologia molecular. Por exemplo, a presença do transgene no genoma vegetal pode ser confirmada através de Southern-blotting ou de PCR e a confirmação da sua transcrição e acumulação dos transcritos pode ser realizada por Northern-blotting, por RT-PCR (reação em cadeia da polimerase pela transcriptase reversa) ou por hibridação in situ.
