Primer (ou Iniciador Molecular)

Conceito de Primer

Primer ou iniciador molecular refere-se a uma sequência de oligonucleótidos, escrita sempre na direção 5`→3`, que marca as extremidades da sequência de DNA alvo que se pretende sintetizar. Para tal, são necessários dois primers: um complementar à sequência de DNA anti-sense (primer sense – forward); e outo complementar à sequência de DNA sense (primer anti-sense – reverse). Por outras palavras, a sequência flanqueada pelos iniciadores moleculares ou primers é a secção do DNA que se amplifica. Os primers são normalmente usados em Reações de DNA Polimerase em Cadeia (Polymerase Chain Reaction, PCR) e uma vez formado o complexo, primer e sequência de DNA alvo, a DNA polimerase liga-se ao grupo OH da extremidade do carbono 3′ do primer (extremidade 3′ OH) para dar início ao processo de síntese. Assim, o desenho de primers é um processo extremamente crítico para o sucesso do PCR e deverá ter em conta os seguintes critérios:

1. A região do primer complementar à sequência do DNA template, deverá ser de 17-28 pares de base (pb). Na prática, são comummente utilizados primers com um comprimento de 18-30 pb.
2. O conteúdo de G+C (Guanina+Citosina) deverá estar compreendido entre 40%-60% (G+C), com distribuição homogénea de todas as bases ao longo do comprimento do primer;
3. A terminação 3` deverá ser G ou C, GC ou CG;
4. Não deverão ocorrer repetições invertidas no primer, ou sequências auto-complementares com mais de 3 pb seguidos, de forma a evitar a formação de dímeros de primers;
5. A temperatura de melting (Tm) deverá estar compreendida entre 52 ᴼC-62 ᴼC, e a Tm calculada para o par de “primers” não deverá diferir em mais que 5 ᴼC.