A microscopia é a área de estudo que aplica o microscópio para observar espécimenes com dimensões inferiores a 0,1 mm invisíveis à vista desarmada.
Enquadramento histórico
O microscópio é uma das ferramentas mais importantes para o estudo das estruturas das células. As células foram descritas pela primeira vez em 1665 pelo cientista inglês Robert Hooke no seu livro Micrographia. Utilizando um microscópio construído por si mesmo, Hooke examinou um bocado de cortiça e desenhou e descreveu o que tinha visto. Hooke escolheu o termo célula porque o tecido lhe fez lembrar dos pequenos quartos onde os monges viviam. Curiosamente, o que Hooke viu não foram células vivas mas as paredes celulares de células de cortiça já mortas. Só muito mais tarde, os cientistas perceberam que o interior enclausurado pelas paredes é que é a parte importante das células vivas.
Alguns anos mais tarde, inspirado pelo trabalho de Hooke, o naturalista holandês Anton van Leeuwenhoek visualizou células vivas com as pequenas lentes que ele tinha produzido. Leeuwenhoek era muito hábil a polir lentes era capaz de ampliar imagens mais de 200 vezes. Entre as suas importantes descobertas contam-se bactérias, protistas, células sanguíneas e espermatozóides. Leeuwenhoek foi um dos primeiros cientistas a relatar células de animais. No entanto, Leeuwenhoek era um mercador e não foi formalmente treinado como cientista. Mesmo assim, a sua habilidade, a sua curiosidade e a sua diligência em partilhar as suas descobertas com cientistas da Sociedade Real de Londres trouxe uma consciencialização da vida microscópica para o mundo científico. Infelizmente, Leeuwenhoek não partilhou as suas técnicas e, apenas mais de um século depois, já no final do século XIX, os microscópios estão suficientemente desenvolvidos para os biólogos concentrarem seriamente a sua atenção no estudo das células.
Microscopia óptica de campo claro usa espécimenes fixados e corados
O microscópio óptico, o mais vulgar e usado por estudantes, consiste num tubo de lentes de vidro em cada extremidade. Como contém várias lentes, o microscópio óptico moderno é referido como um microscópio composto. A luz visível passa através do espécimen a ser observado e através das lentes. A luz é refratada pelas lentes, amplificando a imagem.
Duas características de um microscópio determinam como um pequeno objecto pode ser visualizado nitidamente: o poder de resolução e a amplificação. A ampliação é a razão do dimensão da imagem visualizado com o microscópio com a dimensão real do objecto. Os melhores microscópios ópticos geralmente ampliam um objecto não muito mais do que 1000 vezes. A resolução ou o poder de resolução é a capacidade de distinguir detalhes na imagem e define-se como a distância mínima para separar dois pontos individualizados que possam ser vistos nitidamente. O poder de resolução depende da qualidade das lentes e do comprimento de onda da luz usada. À medida que o comprimento de onda diminui, a resolução aumenta.
A luz visível usada pelos microscópios óticos tem comprimentos de onda que variam entre 400 nm (violeta) a 700 nm (vermelho). Este facto limita a resolução do microscópio óptico a detalhes não inferiores que o diâmetro de uma célula bacteriana pequena (aproximadamente 2 µm).
No começo do século XX surgiram versões mais refinadas de microscópios óticos, como também compostos que coram diferentes estruturas celulares, levando à descoberta de organelos no interior das células. O desenvolvimento de corantes foi muito importante, pois o interior de muitas células é transparente. Porém, muitos procedimentos usados para preparar e corar as células para a observação microscópica, também matam as próprias células em sequência.
Actualmente, as células vivas podem ser estudas com microscópios ópticos de diversos tipos. Na microscopia de campo claro (o mais simples dos microscópios ópticos), a imagem é formada pela transmissão de luz através de uma célula e, como há pouco contraste, os detalhes das estruturas celulares não são visíveis. Na microscopia de campo escuro, os feixes luminosos são dirigidos lateralmente e apenas luz difratada entra nas lentes e a célula é visível como um objecto brilhante contra um fundo escuro.
A microscopia de contraste de fase e a de interferência permite visualizar células vivas
A microscopia de contraste de fase e a microscopia de interferência aproveita as variações de densidade dentro da célula. Estas variações na densidade fazem com que várias regiões do citoplasma refratem a luz de forma diferente. Assim, pode-se observar as células vivas em acção, com numerosas estruturas internas a mudar constantemente de forma e localização.
A microscopia de fluorescência revela proteínas e organelos específicos e a confocal produz imagens fluorescentes mais nítidas
A microscopia de fluorescência é usada para detectar a localização de moléculas específicas na célula. As moléculas que se pretendem visualizar são marcadas com corantes fluorescentes que, por sua vez, absorvem energia luminosa de um determinado comprimento de onda e depois libertam alguma dessa energia num comprimento de onda mais longo. Alguns corantes fluorescentes estão ligados covalentemente a anticorpos que, por sua vez, ligam-se às moléculas alvo. Já a microscopia confocal produz uma imagem mais afinada do que a de microscopia de fluorescência padrão e apenas um plano é focado de cada vez. Um computador pode agrupar microfotografias de uma série de planos para criar uma imagem tridimensional.
Existem dois tipos Microscopia electrónica: a de transmissão e a de varrimento
Só com o desenvolvimento dos microscópios eletrónicos se pôde começar a estudar a ultra-estrutura celular a partir dos anos 50 do século XX. Um feixe de electrões energizados que, pela sua carga negativa, pode ser focado por electromagnetos tal como se foca imagens com lentes de vidro no microscópio óptico. Existem dois tipos de microscopia electrónica: A microscopia eletrónica de transmissão (TEM) e a microscopia electrónica de varrimento (SEM). Numa micrografia de TEM só se observa uma secção transversal muito fina da célula mas na SEM observa-se uma imagem tridimensional superficial do espécimen, pois o feixe electrónico não atravessa o espécimen porque este é coberto com uma película de ouro.
