Histoquímica e Citoquímica

São termos comummente utilizados na Histologia e são geralmente usados para indicar os métodos para a…

São termos comummente utilizados na Histologia e são geralmente usados para indicar os métodos para a localização de diferentes compostos nos cortes de tecidos. Estes métodos têm por base reações químicas específicas, ou a interação macromolecular de alta afinidade. Em ambos, o resultado final é, usualmente, a produção de substâncias insolúveis, coradas, ou eletricamente densas, que permitem a localização de compostos específicos nos cortes de tecidos através do microscópio ótico ou eletrónico. Estes métodos têm uma elevada especificidade, conseguindo até detetar compostos de tamanho reduzido como iões de ferro e fosfato. De seguida apresentam-se alguns protocolos de deteção de diferentes compostos em cortes de tecidos:

Ácidos nucleicos

O ácido desoxirribonucleico (ADN) é estudado principalmente pela reação de Feulgen. Este método baseia-se na hidrólise do ADN pelo ácido clorídrico, que promove a retirada das bases púricas e a formação de grupos aldeídos na desoxirribose. Este ADN apresenta radicais livres que, quando em presença do reagente de Schiff (fucsina básica descorada pelo dióxido de enxofre), forma um composto insolúvel e vermelho. A reação de Feulgen apresenta proporcionalidade entre a intensidade da cor produzida e o teor de ADN, permitindo doseá-lo nos núcleos celulares. O ácido ribonucleico (ARN) apresenta uma acentuada afinidade pelos corantes básicos (basófilia), o que faz com que se core fortemente com azul-de-toluidina ou azul-de-metileno. Sabendo que o ARN não é a única substância basófila dos tecidos, torna-se necessário realizar, antes da sua coloração, uma lâmina de controlo com ribonuclease para digerir o ARN presente e, assim, despistar as outras substâncias basófilas.

Enzimas

Existe um grande número de protocolos histoquímicos descritos para a localização de diversas enzimas. A maioria destes protocolos baseia-se na produção de um precipitado fortemente corado ou eletricamente denso no local da atividade enzimática. De seguida apresentam-se alguns exemplos para identificação de certas enzimas:

Desidrogenases, a sua demonstração histoquímica é feita em cortes de tecido não fixado, em solução contendo o substrato adequado e tetrazol, composto que recebe protões (H+) e fracamente corado. Pela ação da enzima, o substrato cede o hidrogénio que é transferido para o tetrazol, reduzindo-o a um composto fortemente corado e insolúvel, formazana, que se precipita no local da atividade enzimática.

Fosfatase ácida, para a sua deteção usa-se o método Gomori, que consiste na incubação de cortes de tecidos fixados em formal numa solução contendo glicerofosfato de sódio e nitrato de chumbo em tampão a pH 5. Pela ação da enzima ocorre a hidrólise do glicerofosfato, com libertação de iões fosfato, que reagem com o nitrato de chumbo, formando o fosfato de chumbo insolúvel, que se precipita no local onde há atividade enzimática. De seguida, processa-se à imersão dos cortes numa solução de sulfeto de amónio, que transforma o precipitado incolor de fosfato de chumbo num precipitado negro de sulfeto de chumbo.

Peroxidases, a sua deteção pode ser efetuada incubando cortes de tecidos, adequadamente fixados, em 3-3’diaminobenzidina (DAB) na presença de peróxido de hidrogénio (comummente designado de água oxigenada). Assim, a DAB é oxidada, produzindo um composto insolúvel e corado. É possível, desta forma, localizar as estruturas que apresentam atividade das peroxidases, tanto no microscópio ótico como no microscópio eletrónico. Como se trata de uma enzima extremamente ativa, produzem-se quantidades de precipitado insolúvel num curto espaço de tempo, permitindo que este método seja de elevada sensibilidade.

Lípidos

São, geralmente, localizados por substâncias corantes que conseguem ser mais solúveis nos lípidos do que no líquido em que essas substâncias estão dissolvidas. Os tecidos contendo os lípidos são imersos em soluções alcoólicas saturadas de corantes muito lipossolúveis e pouco solúveis em álcool. Assim, o corante transfere-se do álcool para os lípidos do tecido, tornando-o colorido. As substâncias corantes mais utilizadas para esta finalidade são o Sudan IV e o Sudan negro que permitem a coloração dos lípidos em vermelho e preto, respetivamente.

Polissacarídeos

Estes compostos podem apresentar-se livres ou ligados a proteínas e lípidos. O único polissacarídeo não ligado a uma proteína e presente no organismo dos mamíferos é o glicogénio. A sua deteção pode ser realizada pela reação do ácido periódico-Schiff, conhecida pela sua abreviação PAS (Periodic Acid-Schiff). Como existem, nos tecidos, outras moléculas, para além do glicogénio, que se coram pelo PAS, é necessário uma lâmina de controlo tratada com a amílase, promovendo, desta forma, a degradação do glicogénio. As estruturas que contêm glicogénio aparecem coradas pelo PAS apenas nas lâminas não submetidas à amílase. As glicoproteínas são proteínas que contêm hidratos de carbono que formam cadeias ramificadas. Algumas glicoproteínas não contêm grupos ácidos (glicoproteínas neutras), outros têm grupos carboxílicos ou apresentam sulfatos na sua constituição (glicoproteínas ácidas). As glicoproteínas neutras podem ser identificadas nos tecidos porque se coram pelo PAS, mesmo após sofrerem a digestão pela amílase. A parte glicídica dos proteoglicanos e das glicoproteínas ácidas reage intensamente com o corante azul-de-alcian.

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