Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)

Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)

Trata-se de uma técnica utilizada em química analítica que se baseia na separação de compostos alvo de uma determinada mistura. A existência de duas fases (estacionária e móvel) permite esta separação uma vez que uma maior afinidade de um composto à fase estacionária permite que a sua eluição pela fase móvel seja mais lenta.

Esta técnica cromatográfica é utilizada em vários campos, sendo disso exemplo, a indústria farmacêutica, no controlo alimentar e de bebidas, no controlo ambiental, análises clínicas, investigação, etc.

Componentes do HPLC:

• Reservatório da fase móvel: onde se colocam os solventes que vão servir como fase móvel no sistema;
• Bomba: gera um fluxo consistente da fase móvel através do sistema HPLC. A alta precisão e reprodutibilidade do fluxo gerado deve-se à presença de dois pistões que executam dois tipos de movimento: um que permite a entrada da fase móvel no sistema e outro que retira o solvente da bomba para os outros componentes do sistema.
• Injetor: introduz automaticamente a amostra no fluxo da fase móvel.
• Coluna tem a função de fase estacionária e permite a separação do(s) composto(s) a analisar, mediante a sua afinidade à fase estacionária.
• Forno da coluna: garante que a temperatura se mantenha constante durante a separação do(s) composto(s) quando atravessam a coluna, permitindo uma maior reprodutibilidade da análise.
• Detetor: permite a identificação e quantificação dos compostos a analisar, por meio de um sinal elétrico que é proporcional à presença e concentração do(s) composto(s) na amostra.
• Sistema de tratamento de dados: Transforma o sinal eléctrico do detector em picos, que em correspondem ao(s) componente(s) da amostra.  Estes picos são integrados pelo sistema e permitem obter áreas, que, por sua vez, pode ser correlacionadas com a concentração dos compostos. O conjunto destes picos tem a designação de cromatograma.
• Fase Reversa: A fase estacionária contém sílica modificada que lhe confere uma natureza apolar, envolvendo a adição de grupos funcionais apolares como por exemplo, cadeias carbonadas de 8 e 18 carbonos (C8 e C18, respetivamente). Neste tipo de sistemas, utiliza-se solventes polares como fase móvel, por exemplo, água e metanol.
• Fase Normal: A coluna apresenta sílica, o que confere uma natureza polar fase estacionária. Por isso, a fase móvel é composto com por solventes de baixa polaridade, como por exemplo, n-hexano, heptano ou iso-octano.
• Troca Iónica: a fase estacionária possui grupos iónicos, como por exemplo, grupos sulfónicos (SO₃^–) ou amónio (NH₃⁺) que podem ser trocados por catiões ou de aniões da amostra.
• Exclusão Iónica: permite a separação de compostos iónicos de compostos neutros, como por exemplo, misturas de ácidos e bases. A separação baseia-se no tamanho molecular, forma e carga. Se um ácido estiver dissociado, o catião e anião não são captados pela fase estacionária. Por outro lado, ácido alvo no seu estado neutro é retido na fase estacionária.
• Interação Hidrofílica: a fase estacionária e analito são geralmente compostos orgânicos neutros ou com carga e são geralmente usados como fase móvel solventes utilizados em fase reversa.
• Exclusão Molecular: Sílicas ou polímeros orgânicos são utilizados como fase estacionária para separar moléculas de diferentes dimensões. O tamanho dos poros utilizados na fase estacionária é adequado ao composto alvo, impedindo que moléculas de maior tamanho sejam eficazmente captadas.