Apoptose

Conceito de Apoptose

A apoptose é um tipo de morte celular programada caracterizada por modificações morfológicas e bioquímicas nas células. As alterações morfológicas dizem respeito ao encolhimento das células, manutenção da integridade do organelo, condensação e fragmentação nuclear, entre outras. Quanto às alterações bioquímicas, estas são caracterizadas pela externalização da fosfatidilserina e por inúmeras clivagens de substratos por enzimas específicas [revisto em (Indran et al., 2011; Ouyang et al., 2012)].

Existem dois tipos de vias apoptóticas: a extrínseca (ou via dos recetores de morte) e a intrínseca (ou via mitocondrial). Relativamente à via extrínseca, esta consiste na ativação de recetores de morte que estão localizados na superfície da membrana celular. Esta via inicia-se quando ocorre uma ligação dos ligandos de morte aos seus correspondentes recetores, como por exemplo ligação do ligando FASL ao recetor FAS/CD95. Estes recetores contêm um domínio extracelular e um domínio intracelular citoplasmático (também conhecido como domínio de morte). Este último é responsável pela transmissão do sinal de morte, levando à ativação dos recetores de morte que, por sua vez, recrutam a molécula adaptora FADD (FAS-proteína associada com domínio de morte) e a pro-caspase-8, levando à formação do complexo de sinalização de indução de morte (DISC). Por sua vez, o complexo DISC ativa a caspase iniciadora pro-caspase-8, que, uma vez na sua forma ativa de caspase-8, pode ativar as caspases executoras através de duas vias: a) cliva diretamente as pro-caspases-3, -6 e -7, acionando assim a via executora da apoptose que, neste caso, é uma via dependente de caspases e independente da via mitocondrial; b) cliva a proteína Bid (proteína pro-apoptótica da família Bcl-2) no fragmento Bid truncado (tBid) que sofre translocação para a mitocôndria onde induz a libertação do citocromo C (cit C). Este, por sua vez, liga-se ao factor-1 apoptótico ativador da peptidase (APAF-1) e à pro-caspase iniciadora -9, formando assim o apoptossoma. Esta estrutura induz a ativação da caspase-9 que por sua vez cliva as pro-caspases executoras -3, -6 e -7 ativando-as, desencadeando-se assim o processo apoptótico [revisto em (Indran et al., 2011; Ouyang et al., 2012; Galluzzi et al., 2012)].

Por outro lado, a via intrínseca é ativada por diferentes condições de stress dentro da célula, como por exemplo danos no DNA, hipoxia, privação de nutrientes essenciais ao crescimento, radiação, entre outros, levando a alterações na permeabilidade da membrana mitocondrial interna. Por conseguinte, estas alterações levam a modificações na permeabilização da membrana mitocondrial externa (MOMP), à perda do potencial de membrana (Δѱm), à paragem de síntese de ATP, à libertação de proteínas pro-apoptóticas e à elevada produção de espécies reativas de oxigénio (ROS). No que diz respeito às proteínas pro-apoptóticas libertadas, estas podem ser divididas em dois grupos: um grupo que induz apoptose numa via dependente de caspases, no qual estão incluídos o cit C, uma proteína de ligação com baixo ponto isoelétrico que inibe diretamente a família dos inibidores da apoptose (IAP) denominada de DIABLO (também conhecida como segundo ativador de caspases derivado da mitocôndria – SMAC) e uma proteína de elevada temperatura (HTRA2); e outro grupo que induz apoptose numa via independente de caspases no qual estão incluídos o fator indutor de apoptose (AIF) e a endonuclease G (EndoG). Relativamente às proteínas DIABLO/SMAC e HTRA2, estas têm como principal papel inibir a função anti-apoptótica de diversos membros da família IAP, levando assim à ativação das caspases executoras -3, -6 e -7, permitindo a progressão do processo apoptótico. Quanto ao factor AIF e à EndoG, após serem libertados pela mitocôndria sofrem translocação para o núcleo onde vão levar à fragmentação do DNA. A via mitocondrial da apoptose é sobretudo controlada e regulada pelos membros da família da Bcl-2. Esta família que é constituída por membros anti-apoptóticos (Bcl-2, Bcl-Xl, Bcl-W, Bfl-1 e Mcl-1) e por membros pro-apoptóticos (Bax, Bak, Bad, Bcl-Xs, Bid, Bik, Bim, Hrk, Puma e Noxa) regula a libertação do cit C da mitocôndria. Neste sentido, quando ocorre interação entre as proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 e Bcl-Xl e as proteínas mitocondriais responsáveis pela formação de poros há uma proteção da integridade da membrana mitocondrial, o que faz com que não ocorra libertação do cit C. Por outro lado, a proteína pro-apoptótica Bax pode homodimerizar ou heterodimerizar com Bak ou tBid, levando à formação de poros mitocondriais, ficando assim a libertação de cit C favorecida. Ao ocorrer libertação desta proteína apoptótica, como referido anteriormente, esta liga-se ao APAF-1 e à pro-caspase-9, formando a estrutura do apoptossoma. Este complexo leva então à formação da caspase-9 ativa que, por sua vez, ativa as pro-caspases-3, -6 e -7, desencadeando assim o processo apoptótico. Adicionalmente, será importante referir que as proteínas pro-apoptóticas Puma e Noxa também contribuem para o processo apoptótico uma vez que bloqueiam os efeitos das proteínas anti-apoptóticas na mitocôndria [revisto em (Elmore, 2007; Indran et al., 2011; Ouyang et al., 2012; Galluzzi et al., 2012)].

Existem diferentes métodos para determinar a apoptose [revisto em (Ulukaya et al., 2011)]:

1. Morfológicos (baseados em diferentes tipos de microscopia);
2. Imunohistoquímicos (incluem os ensaios de Anexina V-FITC, TUNEL, deteção do antigénio M30, deteção de ativação de caspase-3);
3. Bioquímicos (incluem eletroforese em gel de agarose para avaliar a fragmentação do DNA, Western blotting para avaliar a ativação da caspase-3 e a libertação do citocromo C e Citometria de fluxo para analisar a exposição da fosfatidilserina- Anexina V-FITC);
4. Imunológicos (incluem a técnica de ELISA para deteção do antigénio M30 e métodos Fluorimétricos para detetar caspases ativas);
5. Arrays (o DNA microarray é uma técnica relativamente recente que permite detetar num só ensaio diferentes genes relacionados com apoptose, sendo por isso considerado de certa forma uma tecnologia efetiva e de baixo custo).

References:

• Elmore S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol Pathol 2007 Jun; 35 (4): 495-516;
• Galluzzi L, Vitale I, Abrams JM, Alnemri ES, Baehrecke EH, Blagosklonny MV, Dawson TM, Dawson VL, El-Deiry WS, Fulda S, Gottlieb E, Green DR,Hengartner MO, Kepp O, Knight RA, Kumar S, Lipton SA, Lu X, Madeo F, Malorni W, Mehlen P, Nuñez G, Peter ME, Piacentini M, Rubinsztein DC, Shi Y, Simon HU, Vandenabeele P, White E, Yuan J, Zhivotovsky B, Melino G, Kroemer G. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death Differ 2012 Jan; 19 (1): 107-120;
• Indran IR, Tufo G, Pervaiz S, Brenner C. Recent advances in apoptosis, mitochondria and drug resistance in cancer cells. Biochim Biophys Acta 2011 Jun; 1807 (6): 735-45;
• Ouyang L, Shi Z, Zhao S, Wang FT, Zhou TT, Liu B, Bao JK. Programmed cell death pathways in cancer: a review of apoptosis, autophagy and programmed necrosis. Cell Prolif 2012 Dec; 45 (6): 487-498;
• Ulukaya E, Acilan C, Ari F, Ikitimur E, Yilmaz Y. A Glance at the methods for detection of apoptosis qualitatively and quantitatively. Turk J Biochem 2011 May; 36 (3): 261-269.