O fracionamento celular é uma técnica de isolamento/ purificação de diferentes partes das células como por exemplo os organelos celulares com o intuito de se poder analisá-las por métodos físicos e químicos.
O fracionamento celular representa uma forma alternativa e/ou complementar à microscopia para se estudar com maior detalhe o funcionamento dos organelos subcelulares.
O primeiro passo para o fracionamento celular é a lise, ou seja, rompimento das membranas e/ou das paredes das células mas de forma tão delicada quanto possível. Para tal, as células são suspendidas numa solução de pH e concentração de sais adequadas que devem ser semelhantes àquelas encontradas no interior das células. De seguida, a suspensão de células vai ser sujeita à exposição a ultra-sons num sonificador ou à agitação numa liquidificadora de alta velocidade para provocar a lise das células.
A mistura obtida com as células lisadas é chamada de extrato celular e é normalmente sujeita à força centrífuga por rotação num aparelho designado por centrífuga.
Uma ultracentrifuga pode girar a velocidades que excedem as 100 000 rotações por minuto (rpm), produzindo uma força centrífuga de 500 000x G (um G é igual à força da gravidade). A força centrífuga separa o extrato em duas frações:
a) o pellet;
b) e o supernadante.
O pellet que se forma no fundo do tubo contém materiais mais pesados como os núcleos da célula comprimidos juntos num sedimento. O supernadante, o líquido que envolve o pellet, contém partículas mais leves, moléculas dissolvidas e iões.
O sobrenadante pode ser recolhido e ser centrifugado novamente a uma velocidade superior de forma a obter um pellet que ontem os seguintes componentes celulares mais pesados como, por exemplo, as mitocôndrias e os cloroplastos.
Numa centrifugação diferencial, o supernadante é girado a velocidades sucessivamente superiores, permitindo a separação dos vários componentes celulares de acordo com as suas diferenças de densidade e de tamanho.
Os componentes celulares nos pellets resuspendidos podem ainda ser mais purificados pela centrifugação em gradiente de densidade.
Neste processo, um tubo é preenchido com uma série de soluções com densidades decrescentes. Podem ser usadas, por exemplo, soluções de sacarose. A concentração da sacarose é mais elevada no fundo do tubo e diminui gradualmente até ao topo. O pellet ressuspendido é colocado numa camada do topo do gradiente de densidade. Como a densidade dos diferentes organelos difere, durante a centrifugação cada organelo migra e forma uma banda na posição aonde no gradiente a sua própria densidade iguala àquela da solução de sacarose.
O sucesso na pureza das estruturas subcelulares isoladas nas preparações pode ser avaliado pela morfologia através de observação por microscopia eletrónica ou pela presença de marcadores moleculares. Por exemplo, as mitocôndrias podem ser identificadas pela presença da proteína citocromo c; os peroxissomas pela presença da catalase; os lisossomas pela presença da fosfatase ácida; o retículo endoplasmático rugoso pela presença de ribossomas, etc.
Os organelos são examinados para se poder determinar o tipo de proteínas e outras moléculas que estão presentes e também a natureza das reações químicas que se desenrolam nelas.
References:
- Lodish, H. et al. (2004). Molecular Cell Biology, 5th edition, New York, NY, W.H. Freeman and Company.
- Sadava, et al. (2014). Life: The Science of Biology, Tenth Edition, Sinauer Associates.
