Concept de GFP – Protéine Fluorescente Verte
La protéine fluorescente verte, GFP (de l’anglais Green Fluorescent Protein), est la première protéine naturellement fluorescente à avoir été identifiée. Sa découverte a révolutionné les sciences biologiques, permettant la visualisation de cellules, organelles et processus biologiques, entre autres.
Structure et propriétés biochimiques
La GFP est une petite protéine constituée de 238 acides aminés qui forment onze chaines β antiparallèles, dont l’ensemble forme un cylindre au centre duquel se trouve une hélice α. Après cyclisation et oxydation de trois des acides aminés de l’hélice centrale, les acides aminés: sérine, tyrosine et glycine (en positions 65, 66 e 67), il se forme un chromophore, un groupe chimique ayant la capacité d’absorber et d’émettre de la lumière. Quand un rayonnement ultraviolet (UV) ou bleu incide sur le chromophore, celui-ci absorbe la lumière et, ensuite, il libère de l’énergie en émettant une lumière verte. Les extrémités N-terminale et C-terminale de la GFP sont libres et accessibles pour la liaison d’autres protéines.
La GFP est une protéine stable, qui tolère des températures jusqu’à 65ºC et un pH de 5.5 à 12.2 et elle est résistante aux traitements prolongés par protéases. Elle ne nécessite ni substrat ni cofacteurs pour fluorescer.
La forme monomérique de la GFP sauvage présente un pic d’excitation à 395 nm et un pic plus petit à 475 nm, donnant une émission unique à 509 nm, localisée dans la zone verte du spectre visible. La substitution de la sérine (Ser65) par la thréonine (Thr65) a créé une forme mutante améliorée de la GFP, l’EGFP (de l’anglais Enhanced Green Fluorescent Protein), 6 fois plus fluorescente, qui présente un pic prédominant à 488nm et une émission maintenue à 509nm.
Découverte
La GFP a été découverte en 1962, par le chercheur Osamu Shimomura et ses collaborateurs, aux laboratoires Friday Harbor de l’Université de Washington, quand ils étudiaient la bioluminescence de la méduse Aequorea victoria, un cnidaire présent dans l’Océan Pacifique au large de l’Amérique du Nord. Shimomura a isolé et purifié une protéine bioluminescente dépendante du calcium, qu’il appela aequorine (faisant référence à la méduse) et vérifia la présence d’une autre protéine, qui présentait une forte fluorescence verte quand celle-ci était exposée aux rayonnements UV. Cette protéine a été alors dénommée protéine fluorescente verte ou GFP.
Ils ont constaté que lorsque l’aequorine se lie au calcium, celle-ci émet une lumière bleue qui est absorbée, à son tour, par la GFP conduisant à l’émission d’une lumière verte.
À la fin des années 1980, le chercheur américain Martin Chalfie a commencé à travailler avec la GFP, avec pour objectif l’utilisation du gène de cette protéine pour visualiser l’activation d’autres gènes et la production des protéines qui s’ensuit. Chalfie et ses collaborateurs ont identifié l’emplacement du gène responsable de la synthèse de la GFP dans le génome de l’Aequorea victoria. En 1994, ils ont réussi à intégrer ce gène, par manipulation génétique, dans la bactérie Escherichia coli, qui exhiba la lumière verte caractéristique de la GFP quand elle était éclairée par une lumière UV. Ensuite, ils ont inséré le gène de la GFP chez le nématode Caenorhabdistis elegans et ont pu visualiser et comprendre, pour la première fois, le développement des cellules nerveuses.
En 1996, un autre groupe de chercheurs a éliminé les introns du gène de la GFP permettant son application chez les plantes.
Plus tard, Roger Y. Tsien a amplifié le spectre chromatique des protéines fluorescentes. L´échange des acides aminés dans la séquence de la protéine GFP a permis d’obtenir des variantes dans les régions du bleu (BFP), du cyan (CFP) et du jaune (YFP). L’obtention d’une fluorescence dans les zones de l’orange et du rouge n’a été possible qu’après la découverte, par Sergey Lukyanov, d’une autre protéine similaire à la GFP mais avec une fluorescence rouge. La protéine DsRED (de l’anglais Desired RED protein) a été retrouvée dans un corail bioluminescent du genre Discosoma. Tsien et ses collaborateurs ont mis au point de nouvelles variantes de la GFP, à partir de cette protéine, auxquelles ils ont donné des noms de fruits selon la couleur présentée: mPlum, mCherry, mStrawberry, mOrange e mCitrine. Par la suite, d’autres chercheurs ont contribué à l’élargissement du spectre, permettant le marquage avec de différentes couleurs et l’observation de plusieurs processus en simultané.
En 2008, Osamu Shimomura, Martin Chalfie et Roger Tsien ont reçu le prix Nobel de chimie pour la découverte et le développement d’études et d’applications de la GFP comme marqueur biologique.
Applications des protéines fluorescentes
Les protéines fluorescentes sont très versatiles et sont utilisées que ce soit en microbiologie, en génie génétique ou en physiologie. À travers des techniques de l’ADN recombinant, le gène de la GFP (ou de protéines similaires) peut être introduit dans des cultures de cellules vivantes ou dans des cellules spécifiques présentes dans un organisme intact.
Elles sont utilisées comme des sondes et, de ce fait, elles permettent l’observation de processus jusqu’alors invisibles, tels que le développement des neurones, la croissance et la dispersion de cellules cancérigènes, le développement de la maladie d’Alzheimer, la croissance de bactéries pathogènes, la prolifération du virus du SIDA, le processus d’infection parasitaire (par exemple dans la maladie de Chagas), l’évolution des premières cellules de l’embryon, entre beaucoup d’autres. Elles sont aussi utilisées dans le domaine de la biotechnologie environnementale dans la détection de métaux lourds et de trinitrotoluène (TNT) dans des puits d’eau douce. Dans ce cas, on utilise des bactéries génétiquement modifiées, résistantes au polluant en question, qui émettent de la fluorescence en sa présence.
References:
- Alberts, B. et al. (2008). Molecular biology of the cell. 5th ed. New York: Garland Science. p592-598.
- Charlfie, M. and Kain, S. R. (2006). Green fluorescent protein: Properties, applications and protocols. 2nd ed. New Jersey: Wiley – Interscience.
- Lodish, H. et al. (2004). molecular cell biology. 5th ed. New York: W.H. Freeman. p188-189.
- Xiao, J. (2009). Single-molecule imaging in living cells. In: Hinterdorfer, P. and Van Oijen A. Handbook of single-molecule biophysics. New York: Springer. p46-84.
