Concepto de Northern Blot
Northern blot se refiere a una técnica utilizada en biología Molecular en la cual es estudiada la expresión genética a través de la detección de de ARN mensajero en la muestra en análisis. Esta técnica hace posible averiguar si un gen está siendo transcrito en ARN y cuáles son sus niveles de expresión durante las diferentes fases del ciclo celular tanto en situaciones normales como en situaciones anormales de enfermedad. Siendo descrita por James Alwine, David Kemp y George Stark, en 1977 en la Universidad de Stanford, adoptó su nombre por ser una variación del Soythern blot. La técnica se basa en la separación de las moléculas de ARN por peso molecular a través de una electroforesis, siguiendo la transferencia para una membrana y la detección de la molécula de ARN mensajero de interés por hibridación parcial de una sonda específica.
Procedimiento:
- Extracción del ARN de una muestra biológica (células o tejido);
- Desnaturación de las moléculas de ARN para convertirse en moléculas de estructura primaria, recurriéndose a la adicción de formaldehído en el gel de la electroforesis;
- Separación de las moléculas de ARN presentes en la muestra de acuerdo con su peso molecular, a través de una electroforesis en gel (aparecerá un smear en gel debido al elevado número de moléculas de ARN presentes en cada muestra);
- Transferencia para membrana de nitrocelulosa o de nylon, cargada positivamente, a través de acción capilar u otros sistemas. A continuación, la membrana es calentada (en el caso de la utilización de una membrana de nitrocelulosa) o expuesta a radiación UV (en el caso de la utilización de una membrana de nylon) para fijar permanentemente el ARN a la membrana;
- Tratamiento de la membrana con la sonda, que se define como una molécula de ADN o ARN de cadena simple cuya secuencia es conocida y complementar a la secuencia (total o parcial) de ARN mensajero que se quiere estudiar, haciendo posible la hibridación por complementariedad entre la sonda y la secuencia de interés. La sonda es marcada con átomos radioactivos, colorante fluorescente o una enzima que genera señal cuando entra en contacto con un sustrato, de forma a hacer posible la detección de los lugares de hibridación;
- Lavado de la membrana con el objetivo de retirar toda la sonda que no hibridó, permaneciendo en la membrana apenas la sonda que hibridó por complementariedad de bases con la secuencia de interés;
- Detección del patrón de hibridación, donde se utiliza autoradiografía en film de rayos X en el caso de las ondas concebidas con átomos radioactivos y colorante fluorescente o un método de detección cromogénico en el caso de las zonas concebidas con enzimas. En el caso de no ocurrir hibridación por no existir la secuencia de ARN mensajero de interés en la muestra de estudio, apenas el marcador molecular emitirá color.
