Concepto de Fraccionamento Celular
El fraccionamiento celular es una técnica de aislamiento/purificación de diferentes partes de las células como por ejemplo los organelos celulares con el objetivo de poder analizarlas por métodos físicos y químicos.
El fraccionamiento celular representa una forma alternativa y/o complementaria al microscopio para estudiarse con mayor detalle el funcionamiento de los organelos subcelulares.
El primer paso para el fraccionamiento celular es la lisis, es decir, rotura de las membranas y/o de las paredes de las células pero de la forma más delicada posible. Para ello, las células son suspendidas en una solución de pH y concentración de sales adecuadas que deben ser semejantes a aquellas encontradas en el interior de las células. A continuación, la suspensión de células va a ser sujeta a la exposición de ultrasonidos en un sonificador o de la agitación en una licuadora de alta velocidad para provocar la lisis de las células.
La mezcla obtenida con las células lisadas es llamada extracto celular y es normalmente sujeta a la fuerza centrifuga por rotación en un aparato designado centrifugadora.
Una ultracentrifugadora puede girar a velocidades que exceden las 100 000 rotaciones por minuto (rpm), produciendo una fuerza centrífuga de 500 000x G es igual a la fuerza de la gravedad). La fuerza centrífuga separa el extracto en dos fracciones:
- el pellet;
- y el
El pellet que se forma en el fondo del tubo contiene materiales pesados como los núcleos de la célula comprimidos juntos en un sedimento. El sobrenadante, el líquido que envuelve el pellet contiene partículas más leves, moléculas disueltas e iones.
El sobrenadante puede ser recogido y ser centrifugado nuevamente a una velocidad superior de forma a obtener un pellet que contiene los siguientes componentes celulares más pesados como, por ejemplo, las mitocondrias y los cloroplastos.
En un centrifugado diferencial, el sobrenadante es girado a velocidades sucesivamente superiores, permitiendo la separación de los varios componentes celulares de acuerdo con sus diferencias de densidad y de tamaño.
Los componentes celulares en los pellets suspendidos pueden aún ser más purificados por la centrifugación en gradiente de densidad.
En este proceso, un tubo es rellenado con una serie de soluciones con densidades decrecientes. Pueden ser usadas, por ejemplo, soluciones de sacarosa. La concentración de la sacarosa es más elevada en el fondo del tubo y disminuye gradualmente hasta el tope. El pelelt suspendido es colocado en una capa del tope del gradiente de densidad. Como la densidad de los diferentes organelos difiere, durante la centrifugación cada organelo migra y forma una banda en la posición donde en el gradiente, su propia densidad iguala a aquella de la solución de sacarosa.
El éxito en la pureza de las estructuras subcelulares aisladas en las preparaciones puede ser evaluado por la morfología a través de observación por microscopio electrónico o por la presencia de marcadores moleculares. Por ejemplo, las mitocondrias pueden ser identificadas por la presencia de la proteína citocromo c; los peroxisomas por la presencia de la catalasa; los lisosomas por la presencia de la fosfatasa ácida; el retículo endoplasmático rugoso por la presencia de ribosomas, etc.
Los organelos son examinados para poder determinarse el tipo de proteínas y otras moléculas que están presentes y también la naturaleza de las reacciones químicas que se desenrollan en ellas.
References:
- Lodish, H. et al. (2004). Molecular Cell Biology, 5th edition, New York, NY, W.H. Freeman and Company.
- Sadava, et al. (2014). Life: The Science of Biology, Tenth Edition, Sinauer Associates.
