Concepto de Cromatografía Líquida
La cromatografía es una técnica de separación de componentes de una mezcla, entre una corriente de fluido en movimiento, llamada fase móvil y una fase estacionaria adyacente. Según sea la fase móvil, esta técnica puede ser clasificada en dos tipos: líquida o gaseosa.
Para los casos en que la fase móvil usada es líquida, la operación es designada cromatografía líquida (LC), para la separación de compuestos más volátiles la cromatografía gaseosa (CG), que usa una fase móvil gaseosa, es una técnica de alta aplicabilidad. Son las fuerzas físicas y químicas que actúan entre los solutos y las dos fases (móvil y estacionaria) las que son responsables por la retención de los solutos en la columna cromatográfica. A medida que la fase móvil eluye sobre la fase estacionaria los solutos son separados de acuerdo con la interacción de éstos con las fases, eluyendo primero los que tienen mayor afinidad con la fase móvil y a continuación los que tienen mayor afinidad con la fase estacionaria. Las fuerzas elementales que actúan sobre las moléculas son de cinco tipos: 1) Fuerzas de dispersión de London o fuerzas de Van der Waals; 2) Interacciones de dipolo inducido; 3) Enlaces de hidrógeno; 4) Interacciones dieléctricas; 5) Interacciones electroestáticas y coulombianas. Las variables que afecten a esas fuerzas intermoleculares influirán en el grado de separación obtenido por el paso de los solutos a través de la columna cromatográfica.
En lo que se refiere a la cromatografía líquida ésta puede aún ser dividida en cromatografía líquida clásica (CLC) y cromatografía líquida de alta eficiencia (CLAE) o HPLC del inglés High Performance Liquid Chromatography.
En la cromatografía líquida clásica, se utilizan columnas con diámetros relativamente grandes, empaquetadas con fases estacionarias finamente divididas, donde la fase móvil es arrastrada a través de la columna apenas por la fuerza de la gravedad y las fracciones individuales de la muestra son colectadas manualmente o a través de un colector de fracciones. Las separaciones requieren, generalmente, varias horas y la detección y cuantificación de las fracciones son realizadas por análisis manual. Este método separa mezclas bastante complejas, aunque es demorada y necesita que sea realizado examen químico o espectroscopio de las fracciones colectadas.
En este método el relleno de la columna es utilizado generalmente una sola vez, porque parte de la muestra usualmente se adsorbe de forma irreversible. El relleno de la columna debe ser repetido para cada separación. La aplicación de la muestra, para ser hecha correctamente, requiere alguna habilidad, hechos que representan un desperdicio de recursos como material y tiempo. Esta técnica es muy utilizada para el aislamiento de productos naturales y purificación de productos de reacciones químicas. Las fases estacionarias más utilizadas son el sílice y la alúmina, mientras tanto, estos adsorbentes pueden servir simplemente como soporte para una fase estacionaria líquida. Las fases estacionarias sólidas llevan a la separación por adsorción y en las líquidas la separación es realizada por partición.
En lo que se refiere a la cromatografía líquida de alta eficiencia, ésta utiliza columnas cerradas que contienen partículas muy finas que proporcionan separaciones muy eficientes pero ofrecen una gran resistencia al flujo de la fase móvil. Por esta razón es necesario el uso de sistemas de bomba de alta presión para forzar el paso del solvente, a una velocidad razonable, y así disminuir el tiempo del análisis. Las columnas utilizadas en esta técnica tienen la ventaja de ser reutilizables, así, centenas de separaciones individuales pueden ser efectuadas con la misma columna. Los constituyentes de este tipo de técnica incluyen el sistema de soporte para solventes, el inyector, la bomba, la columna, el detector y finalmente la adquisición y tratamiento de datos. Esta técnica tiene la capacidad de realizar separaciones y análisis cuantitativos de una gran cantidad de compuestos presentes en varios tipos de muestras, en un espacio corto de tiempo (pocos minutos), con alta resolución, eficiencia y sensibilidad. La utilización de soportes con partículas reducidas son los responsables por la alta eficiencia de este método de cromatografía. El soluto interactúa con las fases estacionaria y móvil por adsorción, partición exclusión molecular, intercambio iónico. Las separaciones en HPLC pueden ser realizadas por adsorción (separación sólido-líquido), partición (separación líquido-líquido) o ambos. Varios tipos de detectores, que pueden ser colocados en la salida de la columna, proporcionan una identificación y cuantificación continua de los componentes de la muestra. El detector más utilizado para separaciones por HPLC es el detector de ultravioleta (absorción de la luz en la franja UV – visible), siendo también utilizados detectores de fluorescencia, de índice de refracción, electroquímicos, así como el acoplamiento a espectómetros de masas. Con éstos, se hizo posible la detección de la mayoría de los compuestos y el análisis de analitos en muestras complejas siendo ellas biológicas como sangre, orina, plasma, cabello y no biológicas como suelo, alimentos, petróleo, etc. Como resultado, dificultades anteriores o separaciones difíciles de compuestos como colorantes polares, isómeros, drogas básicas y sus metabolitos forman ahora parte de las rutinas de laboratorio.
