Conceito de Northern Blot
Northern blot diz respeito a uma técnica utilizada na Biologia Molecular na qual é estudada a expressão genética através da detecção de RNA mensageiro na amostra em análise. Esta técnica torna possível averiguar se um gene está a ser transcrito em RNA e quais os seus níveis de expressão durante as diferentes fases do ciclo celular tanto em situações normais como em situações anormais de doença. Tendo sido descrita por James Alwine, David Kemp, and George Stark, em 1977 na Universidade de Stanford, adotou o seu nome por ser uma variação ao Southern blot. A técnica baseia-se na separação das moléculas de RNA por peso molecular através de uma electroforese, seguindo-se a transferência para uma membrana e a detecção da molécula de RNA mensageiro de interesse por hibridação parcial de uma sonda específica.
Procedimento:
- Extração do RNA de uma amostra biológica (células ou tecido);
- Desnaturação das moléculas de RNA para se tornarem moléculas de estrutura primária, recorrendo-se à adição de formaldeído no gel da electroforese;
- Separação das moléculas de RNA presentes na amostra de acordo com o seu peso molecular, através de uma electroforese em gel (aparecerá um smear no gel devido ao elevado número de moléculas de RNA presentes em cada amostra);
- Transferência para membrana de nitrocelulose ou de nylon, carregada positivamente, através de ação capilar ou outros sistemas. Seguidamente, a membrana é aquecida (no caso da utilização de uma membrana de nitrocelulose) ou exposta a radiação UV (no caso da utilização de uma membrana de nylon) para fixar permanentemente o RNA à membrana;
- Tratamento da membrana com a sonda, que se define como uma molécula de DNA ou RNA de cadeia simples cuja sequência é conhecida e complementar à sequência (total ou parcial) de RNA mensageiro que se quer estudar, tornando possível a hibridação por complementaridade entre a sonda e a sequência de interesse. A sonda é marcada com átomos radioativos, corante fluorescente ou uma enzima que gera sinal quando entra em contato com um substrato, de forma a tornar possível a detecção dos locais de hibridação;
- Lavagem da membrana com o objetivo de retirar toda a sonda que não hibridou, permanecendo na membrana apenas a sonda que hibridou por complementaridade de bases com a sequência de interesse;
- Detecção do padrão de hibridação, onde se utiliza autoradiografia em filme de raio-X no caso das sondas concebidas com átomos radioativos e corante fluorescente ou um método de detecção cromogénico no caso das sondas concebidas com enzimas. No caso de não ocorrer hibridação por não existir a sequência de RNA mensageiro de interesse na amostra em estudo, apenas o marcador molecular emitirá cor.
