Em 1903, Mikhail Tswett (1872 – 1919) descreveu a separação de pigmentos de folhas de plantas em solução através do uso de adsorventes sólidos. Denominou a este processo de cromatografia (do grego: chroma, cor + graphein, para escrever), presumivelmente devido à formação de bandas coloridas nos adsorventes assim que os componentes da mistura de pigmentos se separam uns dos outros.
Uma característica importante de muitas proteínas é a sua capacidade de se ligar a moléculas específicas de uma forma não covalente. Esta propriedade pode ser usada na purificação de proteínas através da cromatografia de afinidade. Nesta técnica, a molécula, conhecida como o ligando, que se liga especificamente à proteína de interesse, está covalentemente ligada a uma matriz inerte e porosa. Quando uma mistura passa através deste material cromatográfico, a proteína de interesse liga-se ao ligando imobilizado, enquanto outras substâncias são eluídas ao longo da coluna com o tampão. A proteína-alvo pode assim ser recolhida numa forma altamente purificada a partir da alteração das condições de eluição até que a proteína seja libertada da matriz cromatográfica. A grande vantagem da cromatografia de afinidade é a sua capacidade de explorar as propriedades únicas das proteínas ao invés de pequenas diferenças nas propriedades físico-químicas entre as proteínas.
A matriz cromatográfica da cromatografia de afinidade tem que ser quimicamente inerte, ter alta porosidade e possuir um grande número de grupos funcionais capazes de formar ligação covalentes com o ligando. Um dos poucos materiais disponíveis que segue estes critérios é a agarose. Esta possui numerosos grupos hidroxilo livres, sendo a matriz mais utilizada. Se o ligando tem um grupo amina primário que não é essencial para a sua ligação à proteína de interesse, o ligando pode ser ligado covalentemente à agarose num processo de dois passos:
- A agarose reage com o brometo de cianogénio para formar um intermediário ativo mas estável;
- O ligando reage com a agarose ativada para formar um produto covalentemente ligado.
Muitas proteínas são incapazes de interagir com o ligando acoplado ao brometo de cianogénio, devido a interferências estéricas com a matriz de agarose. Este problema é resolvido através da inclusão de espaçadores entre a matriz de agarose e o ligando. Isto é conveniente efetuado através do uso de resinas comerciais ativadas. Uma dessas resinas é a agarose ativada com epóxis, em que o grupo espaçador (contendo até uma dúzia de átomos) se liga à resina a um grupo epóxi reativo. O grupo epóxi pode reagir com muitos grupos nucleofilicos dos ligandos, permitindo, deste modo, que o ligando escolhido se ligue covalentemente à agarose através de uma cadeia com um comprimento definido.
O ligando usado na separação de uma proteína particular através da cromatografia de afinidade tem que possuir uma afinidade suficientemente elevada para se ligar à proteína, mas não de um grau tão elevado ao ponto de evitar a sua eluição.
Após a ligação da proteína à coluna cromatográfica, esta tem que ser libertada da matriz. Um dos métodos é passar na coluna uma solução de um composto que tenha uma maior afinidade do que a proteína para o local da ligação à coluna. Outra forma é alterar as condições da solução de uma forma em que o complexo ligando-proteína não permaneça de uma forma estável, como por exemplo, alterando o pH, a força iónica e ou a temperatura. No entanto, é necessário algum cuidado ao manusear estas condições para não danificar a proteína de interesse.
A cromatografia de afinidade tem sido utilizada na purificação de substâncias, como enzimas, anticorpos, proteínas transportadoras, recetores de hormonas, membranas e até células. Por exemplo, já se conseguiu ligar a insulina, uma hormona proteica, a uma matriz de agarose para purificar um recetor de insulina. O poder de separação da cromatografia de afinidade é, usualmente, bastante maior do que outras técnicas cromatográficas. Na verdade, a substituição de vários passos cromatográficos por um só em que use cromatografia de afinidade na separação de uma proteína de interesse leva a maiores rendimentos.
Outros assuntos relacionados:
– Cromatografia líquida
– Cromatografia gasosa
– Espectrometria de massa
References:
- Dean, P.D.G., Johnson, W.S., and Middle, F.A. (Eds.), Affinity Chromatography. A Practical Approach, IRL Press (1985)
