Conceito de Mutagénese Dirigida
As propriedades das proteínas podem ser alteradas por mutagénese dirigida ou evolução direcionada / evolução experimental in vitro. Esta última técnica não necessita do conhecimento da estrutura da proteína. Baseia-se nos princípios da evolução natural, isto é, na produção de variabilidade e seleção. No entanto, neste caso a seleção é realizada pelo cientista. A diversidade molecular pode ser gerada por mutagénese aleatória de um gene que codifique para determinada proteína ou por quimeragenese de dois ou mais genes. Estas bibliotecas de genes mutantes são então expressas em microrganismos, como por exemplo em Escherichia coli. Os clones que demonstram melhoramento numa propriedade desejada são isolados em high-throughput screens ou seleções. Os clones selecionados podem ainda ser outra vez mutados e/ou recombinados aleatoriamente para serem novamente expressos e selecionados.
A mutagénese dirigida permite realizar a indução de mutações específicas. O estudo das características de uma proteína pode ser realizada por mutagénese dirigida. Um nucleótido específico num gene pode ser substituído por outro nucleótido. Isto pode levar à alteração de um aminoácido da proteína codificada por esse gene.
A mutagénese dirigida é também utilizada para aumentar a expressão proteica em sistemas heterólogos. A utilização de tecnologia de DNA recombinante na produção de proteínas nestes sistemas de expressão está na base da utilização da mutagénese dirigida. Podem-se alterar por mutagénese determinados codões que são pouco utilizados por outros codões equivalentes no DNA. Isto pode, consequentemente, provocar o aumento o rendimento da expressão proteica.
A mutagénese dirigida envolve a utilização de oligonucleótidos mutagénicos sintéticos que emparelham na zona do gene que se pretende alterar. Esses oligonucleótidos possuem uma ou mais bases internas que não emparelham e que especificam a mutação a introduzir. A confirmação de que a mutação foi introduzida pode ser feita por hibridação com o próprio oligonucleótido mutagénico ou por sequenciação de direta de DNA.
