Conceito de Eletroforese de DNA em Gel de Agarose
A técnica de separação dos fragmentos de DNA mais comum é a eletroforese de DNA em géis de agarose. A agarose é um polissacárido que é dissolvido numa solução tampão quente e solidifica à temperatura ambiente. A concentração de agarose determina o tamanho dos poros da matriz de agarose solidificada. Uma maior concentração de agarose faz com que os poros formados apresentem menores dimensões, e por isso permitam a separação de fragmentos de DNA mais pequenos com maior resolução.
A eletroforese de DNA pode também ser realizada em gel de acrilamida caso seja preciso obter uma melhor resolução dos fragmentos. São aplicadas também outras variantes da eletroforese de DNA, tal como a eletroforese pulsed-field (em campo pulsado), a fim de separar grandes moléculas de DNA. Com esta técnica eletroforética podem ser separadas grandes moléculas de DNA como as de um cromossoma. Neste tipo de eletroforese é aplicada uma corrente que alterna entre dois pares de elétrodos. As moléculas de DNA percorrem o gel em ziguezague devido à reorientação que as moléculas de DNA sofrem quando a corrente alterna. A reorientação é mais rápida para moléculas menores. Assim, elas movem-se mais rápido e são separadas das moléculas maiores.
Em relação à eletroforese de DNA em gel em agarose, o DNA previamente tratado é introduzido em pequenos poços de gel numa das extremidades do gel de agarose, previamente formados com o auxílio de um pente. Este gel encontra-se imerso em tampão num tanque de eletroforese. Posteriormente, é então aplicada uma corrente elétrica através do gel posicionado entre dois elétrodos. Como DNA é carregado negativamente em pH neutro, é atraído para o elétrodo positivo. Os fragmentos de DNA menores migram através de um gel de agarose mais rapidamente que os fragmentos de DNA maiores. A velocidade de migração de uma molécula de DNA no gel de agarose é determinada, principalmente, por: tamanho da molécula de DNA, concentração de agarose, conformação do DNA e a tensão aplicada. A relação entre o logaritmo do peso molecular do DNA e a distância percorrida no gel é aproximadamente linear. Assim é possível estimar o tamanho de fragmentos de DNA se compararmos a sua distância de migração com a migração de fragmentos de tamanho conhecido, normalmente, entre os 300 e os 10 000 pares de bases.
Posteriormente, para a visualização do gel é possível utilizar brometo de etídio que é aplicado depois da corrida, ou então GelRed ou outro substituto. Estes químicos intercalam-se no DNA e após exposição a raios UV emitem fluorescência.
