Conceito de Cromatografia Líquida
A cromatografia é uma técnica de separação de componentes de uma mistura, entre uma corrente de fluído em movimento, chamada fase móvel e uma fase estacionária adjacente. Consoante seja a fase móvel, esta técnica pode ser classificada em dois tipos: líquida ou gasosa.
Para os casos em que a fase móvel usada é líquida, a operação é designada por cromatografia líquida (LC), para a separação de compostos mais voláteis a cromatografia gasosa (CG), que usa uma fase móvel gasosa, é uma técnica de alta aplicabilidade. São as forças físicas e químicas que actuam entre os solutos e as duas fases (móvel e estacionária) que são responsáveis pela retenção dos solutos na coluna cromatográfica. Á medida que a fase móvel elui sobre a fase estacionária os solutos são separados de acordo com a interação destes com as fases, eluindo primeiro os que têm maior afinidade com a fase móvel e de seguida os que têm maior afinidade com a fase estacionária. As forças elementares que agem sobre as moléculas são de cinco tipos: 1) Forças de dispersão de London ou forças de Van der Waals; 2) Interações de dipolo induzido; 3) Ligações de hidrogênio; 4) Interações dielétricas; 5) Interações eletrostáticas e coulombianas. As variáveis que afectarem essas forças intermoleculares irão influenciar o grau de separação obtido pela passagem dos solutos através da coluna cromatográfica.
No que diz respeito á cromatografia líquida esta pode ainda ser dividida em cromatografia líquida clássica (CLC) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) ou HPLC do inglês High Performance Liquid Chromatography.
Na cromatografia líquida clássica, utilizam-se colunas com diâmetros relativamente grandes, empacotadas com fases estacionárias finamente divididas, onde a fase móvel é arrastada através da coluna apenas por força da gravidade e as frações individuais da amostra são coletadas manualmente ou através de um coletor de frações. As separações requerem, geralmente, várias horas e a detecção e quantificação das frações são realizadas por análise manual. Este método separa misturas bastante complexas, porém é demorada e necessita que seja feito exame químico ou espectroscópico das frações coletadas.
Neste método o recheio da coluna é utilizado geralmente uma só vez, porque parte da amostra usualmente se adsorve de forma irreversível. O enchimento da coluna deve ser repetido para cada separação. A aplicação da amostra, para ser feita corretamente, requer alguma habilidade, factos que representam um desperdício de recursos como material e tempo. Esta técnica é muito utilizada para isolamento de produtos naturais e purificação de produtos de reações químicas. As fases estacionárias mais utilizadas são a sílica e a alumina, entretanto estes adsorventes podem servir simplesmente como suporte para uma fase estacionária líquida. As fases estacionárias sólidas levam à separação por adsorção e nas líquidas a separação é realizada por partição.
No que diz respeito á cromatografia líquida de alta eficiência, esta utiliza colunas fechadas que contêm partículas muito finas que proporcionam separações muito eficientes mas oferecem uma grande resistência à vazão da fase móvel. Por esta razão é necessário o uso de sistemas de bomba de alta pressão para forçar a passagem do solvente, a uma velocidade razoável, e assim diminuir o tempo da análise. As colunas utilizadas nesta técnica têm a vantagem de serem reaproveitáveis, assim, centenas de separações individuais podem ser efectuadas com a mesma coluna. Os constituintes deste tipo de técnica incluem o sistema de suporte para solventes, o injector, a bomba, a coluna, o detector e por fim a aquisição e tratamento de dados. Esta técnica tem a capacidade de realizar separações e análises quantitativas de uma grande quantidade de compostos presentes em vários tipos de amostras, num espaço curto de tempo (poucos minutos), com alta resolução, eficiência e sensibilidade. A utilização de suportes com partículas reduzidas são os responsáveis pela alta eficiência deste método de cromatografia. O soluto interage com as fases estacionária e móvel por adsorção, partição, exclusão molecular, troca iônica. As separações em HPLC podem se realizadas por adsorção (separação sólido-líquido), partição (separação líquido-líquido) ou ambos. Vários tipos de detectores, que podem ser colocados na saída da coluna, proporcionam uma identificação e quantificação contínua dos componentes da amostra. O detector mais utilizado para separações por HPLC é o detector de ultravioleta (absorção da luz na faixa UV – visível), sendo também utilizados detectores de fluorescência, de indíce de refração, eletroquímicos, bem como o acoplamento a espectrômetros de massas. Com estes, tornou-se possível a detecção da maioria dos compostos e a análise de analitos em amostras complexas sendo elas biológicas como sangue, urina, plasma, cabelo e não biológicas como solo, alimentos, petróleo, etc. Como resultado, dificuldades anteriores ou separações difíceis de compostos como corantes polares, isômeros, drogas básicas e seus metabólitos fazem agora parte das rotinas laboratoriais.
