Conceito de RT-PCR
A técnica de RT-PCR (reverse transcription polimerase chain reaction) utiliza uma enzima especial, a transcriptase reversa, que consegue produzir uma molécula de DNA complementar (cDNA) a partir de uma molécula de RNA. Pode ser utilizada para copiar um gene ou para determinar se um gene está a ser transcrito num determinado tecido ou célula.
Apenas são necessárias pequenas quantidades de RNA mesnageiro (mRNA), das quais serão produzidas posteriormente milhões de cópias, evitando-se a necessidade de uma elevada quantidade de amostra para se detetar e quantificar a expressão de um determinado gene, que em muitos casos seria impraticável. O mRNA também não está presente em grandes quantidades nas células, uma vez que representa uma pequena percentagem do RNA total e também porque é destruído após a tradução.
Inicialmente extrai-se e purifica-se as sequências de mRNA presentes na amostra que se pretende estudar. O mRNA é depois convertido em cDNA pela transcriptase reversa, contudo esta enzima apenas sintetiza uma cadeia simples. A cadeia dupla é produzida por uma DNA polimerase, através da ligação de um primer específico à cadeia de cDNA simples produzida pela transcriptase reversa. Previamente à realização desta técnica de biologia molecular são desenhados dois primers que irão ser complementares da sequência de cDNA alvo. Esses primers são adicionados ao cDNA e irão ligar-se este apenas se a sequência que se quer estudar estiver presente na amostra. Só nesse caso irá ocorrer amplificação do cDNA. Os ciclos de amplificação ocorrem inúmeras vezes, obtendo-se no fim do processo milhões de cópias de cDNA (como acontece durante o PCR convencional) que depois será analisado através de uma eletroforese.
Existem dois tipos de protocolos que poderão ser utilizados para a realização desta técnica:
- One step RT-PCR – a síntese do cDNA e a reação de PCR ocorrem no mesmo tubo. Este protocolo simplifica o processo e minimiza a ocorrência de contaminações. Apresenta elevada sensibilidade, uma vez que os primers a utilizar têm de ser específicos de apenas uma sequência;
- Two step RT-PCR – a primeira etapa inclui a síntese do cDNA. Após a síntese da cadeia simples, o cDNA é transferido para um novo tudo, onde irá ocorrer a reação de PCR. Permite uma maior flexibilidade dos componentes a usar em cada reação e é ideal para a deteção e quantificação de várias sequências.
