Electroforese

Conceito de Electroforese: O uso da electroforese, como técnica analítica, começou com o trabalho do químico sueco Arne Tiselius em 1931. É uma das…

Conceito de Electroforese

O uso da electroforese, como técnica analítica, começou com o trabalho do químico sueco Arne Tiselius em 1931. É uma das técnicas mais importantes usadas em laboratórios para a separação de macromoléculas como por exemplo o ácido desoxirribonucleico (ADN), o ácido ribonucleico (ARN) e proteínas. A sua separação pode ser feita com base no tamanho, densidade e pureza. Permite ainda a detecção de variações genéticas e purificação de proteínas envolvidas na saúde e na doença. É usada também para auxiliar na análise de agentes patogénicos (organismos causadores de doenças) que podem estar presentes tanto no sangue como noutros tecidos ou ainda nos alimentos. Em muitos casos, os ácidos nucleicos ou proteínas que são detectados e purificados com a electroforese em gel são investigados através da sequenciação de ADN ou por espectrometria de massa. Electroforese também pode ser usada para a análise de plasmídeos, melhorando a nossa compreensão de como as bactérias se tornam resistentes aos antibióticos. Devido a ser uma técnica tão poderosa e ainda razoavelmente fácil de usar e barata, tornou-se muito comum. O fundamento desta ténica consiste no movimento das partículas electricamente carregadas, num fluido sob a influência de um campo eléctrico.

Neste método, dois eléctrodos são colocados em extremidades opostas de um papel, de uma coluna, de um gel ou outro meio de suporte apropriado. Uma solução de sal é usada para humedecer o meio e para ligar os eléctrodos electricamente. A mistura a ser separada é colocada no centro do meio de suporte e é aplicado um potencial eléctrico. As proteínas carregadas positivamente vão-se mover em direcção ao eléctrodo com carga negativa (cátodo), enquanto que as proteínas carregadas negativamente vão migrar em direcção ao eléctrodo com carga positiva (ânodo). Electroforese de partículas carregadas positivamente (catiões) é chamada de cataforese, enquanto electroforese de partículas carregadas negativamente (aniões) designa-se por anaforese.

A electroforese pode ser de uma dimensão (isto é, tem um plano de separação) ou bidimensional. Uma electroforese dimensional é utilizada para a maioria das separações de rotina de proteínas e de ácidos nucleicos. A electroforese bidimensional é utilizada para as impressões digitais e quando devidamente construídas, estas técnicas podem ser extremamente precisas na resolução de todas as proteínas presentes dentro de uma célula.

A velocidade de migração em cada sentido depende não só da carga sobre as proteínas, mas também da sua dimensão: assim, proteínas com a mesma carga podem ser separadas. Este exemplo demonstra a separação de espécies carregadas com base nas diferenças de velocidade de migração num campo eléctrico. A extensão de uma tal separação é dependente do tempo, uma característica que distingue tais separações daquelas que são dependentes de equilíbrios. A velocidade pode ser positiva ou negativa, dependendo da direcção. Depende não só do tamanho e da carga eléctrica da molécula, mas também das condições da experiência (por exemplo, a tensão entre os dois eléctrodos). Em analogia com os métodos de equilíbrio, o factor de separação pode ser definido como a relação entre as velocidades de migração para duas proteínas. O grau de separação (isto é, até que ponto uma proteína é removida da outra) depende das diferentes distâncias percorridas pelas duas proteínas. A extensão de separação é directamente proporcional ao tempo de migração no campo eléctrico.

A electroforese é convencionalmente conduzida em placas como na cromatografia em camada fina. Para manter a solução tampão sobre a placa, é necessário algum meio como por exemplo um gel e assim o método passa a ser designado por electroforese em gel. O gel é muitas vezes feito a partir de poliacrilamida ou de agarose. O gel, que contém uma série de poços no final do cátodo, está colocado no interior da câmara e é coberto com uma solução tampão. As amostras são, de seguida, colocadas nas cavidades com uma pipeta. A câmara está ligada a uma fonte de alimentação que, quando ligada, aplica-se um campo eléctrico no tampão. O campo eléctrico faz com que as moléculas carregadas negativamente migrem através do gel para o ânodo.

Electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE, do inglês polyacrylamide gel electrophoresis) tem uma resolução muito mais definida do que a da agarose e é mais adequada para a análise quantitativa.

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